文献解读:非编码RNA的研究现在还能怎么做?

非编码RNA种类繁多,家族庞大。

网络上有段子说连实验室的插枪头阿姨都知道非编码RNA是什么,这也在一定程度上反映了其已经连续多年成为科研的热点,并且火气不退。

以2019年国自然非编码项目统计为例,据报道以“miR、circ、lnc、ceRNA、非编码”作为关键词进行了搜索与统计。去重后仍有1362项,占总数(16616)项的8.20%,资助金额共计54049.4万元,占总金额(768354.53万元)7.03%。医学科学部计1134项(占医学科学部的11.19%)。

毫无疑问,近年来,非编码RNA研究取得了很多重磅级成果。但与早先的主要是在不同类型的疾病中大规模鉴定非编码RNA,最近的研究是对非编码RNA机制的更深入探索,给我们展现了作用方式更丰富多彩的非编码RNA世界。

那么miRNA作为非编码RNA的老牌成员,最近在神经运动领域有什么新的研究进展?

miRNA是如何参与到相关功能的调控过程的?

2019年7月,来自英国苏塞克斯大学生命科学学院、葡萄牙查姆帕利莫德未知中心以及法国国家科学研究中心的研究人员在Current Biology杂志在线发表了题为A Single MicroRNA-Hox Gene Module Controls Equivalent Movements in Biomechanically Distinct Forms of Drosophila的研究论文,作者选取果蝇为研究对象,不仅证明果蝇miR-iab4在其幼虫(包括各龄期幼虫)和成虫自行复位(翻身)中均发挥重要功能,而且揭示miR-iab4发挥功能是通过抑制其靶基因Hox gene Ultrabithorax而实现的。并进一步阐明miR-iab4及其靶基因Hox gene Ultrabithorax 组成的单个基因模块在果蝇自行复位(翻身)这一运动行为中的分子调控机制。

原文链接:

https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.06.082

 背景介绍  

非编码RNA在运动调控中可能的作用
果蝇作为实验研究的传统模式生物,因其生命周期短暂和遗传背景简单的特点,成为遗传学和神经行为学研究的良好材料。协调的运动行为对动物的存活、逃避天敌以及繁殖至关重要。自行复位(翻身)是从昆虫到哺乳动物都具备的一种先天能力,用以保持自身正确的体态。此外,维持这一正常体位对于取食、交配等其它行为运动至关重要。如果果蝇丧失了丧失自行复位能力,那么等待它的只有死亡。

前期研究表明,行为控制的环路也是基于基因表达影响的,然而对于基因组成在果蝇运动行为—翻身中究竟发挥多大作用,特别是之前被认为是“转录噪音”的非编码RNA是否也发挥相关调控作用,都是需要探索的未知科学问题。

研究线路及策略

miR-iab4/8基因座在复位(翻身)中的作用

果蝇的生活史包括4个阶段,分别为卵、幼虫、蛹和成虫。

该研究团队前期在果蝇一龄幼虫阶段发现miR-iab4/8基因座能够影响幼虫的自行复位,该过程的具体分子机制涉及miR-iab4及其靶基因Hox gene Ultrabithorax (Ubx)的调控过程。为明确这一机制是否适用于果蝇发育过程的其它阶段,研究人员对miRNA突变组和对照组进行果蝇自行复位(翻身)所需时间进行比较,发现miR-iab4/8基因座进行突变会影响果蝇幼虫各龄期的翻身所需时间(图1)。

为进一步明确miR-iab4/8基因座所编码的哪一个miRNA(该基因座可编码miR-iab4miR-iab8)参与到果蝇翻身这一行为,研究人员通过遗传互补试验证实miR-iab4参与该效应。随后研究人员在行为观察中发现,果蝇附足在自行复位(翻身)过程中发挥主要作用,特别是前足(T1)和后足(T3),继而作者试图发现miR-iab4与果蝇足部运动可能存在的关联,并通过行为学实验证实在△miR突变的果蝇中,其足部运动特征发生显著改变,包括振幅、动态范围等变小。

图1 移除miR-iab4基因座对各龄期果蝇幼虫及成虫翻身所需时间的影响

 
分子机制研究—miRNA-Hox系统

为进一步探究miR-iab4在果蝇自行复位(翻身)中的分子机制,基于前期幼虫期的研究结果,研究人员推断miR-iab4在成虫中发挥功能也是通过抑制其靶基因Hox gene Ultrabithorax而实现的,并通过研究证实增加Ubx l的表达水平能够抵消由miR-iab4突变缺陷所导致的果蝇自行复位(翻身)。同时,其他研究结果显示Hox基因Ubx在昆虫腹部运动神经元的表达对于维系正常的自行复位(翻身)功能至关重要。

因此,研究人员进一步推测在果蝇成虫足部神经元中的Ubx的调控也许对果蝇自行复位(翻身)有发挥一定作用,为进一步验证该假设,研究人员通过种系特异性的足部运动神经元驱动系统表明Ubx对于果蝇完成自行复位(翻身)所需时间有显著影响,但是同时研究结果也提示在果蝇不同的发育阶段,Ubx所参与的miRNA-Hox系统可能是在不同的细胞中进行的。

 
miR-iab4调控足部运动神经元

足部运动神经元作为果蝇足部运动的直接效应器,在果蝇自行复位(翻身)过程中发挥重要作用。

研究人员通过神经抑制试验证明足部运动神经元VT006878驱动器对于果蝇正常自行复位(翻身)是必须的,进一步的研究发现其不仅仅存在于足部,同时也分布于果蝇的翅和平衡棒的感觉轴突。但研究人员通过巧妙的实验设计(切除)排除了翅和平衡棒在果蝇自行复位(翻身)过程中发挥作用的可能性。

目前,对动物行为生物学的研究目前主要集中在中枢神经系统,本研究发现VT006878驱动导致的Ubx的上调不仅仅出现在果蝇腹节,同时在脑部分散神经元也有类似上调为进一步排除脑部神经参与果蝇自行复位(翻身)这一运动行为,研究人员通过在特定组织中限定表达实验证明Ubx在脑、翅以及平衡棒中的上调对果蝇成虫完成自行复位(翻身)所需时间无显著影响。

此外,研究人员进一步通过RNAi实验表明Ubx蛋白对于正常的自行复位(翻身)是必须的,同时发现其主要分布于T1-T3神经节,特别是T3部分。与之呼应,RNA原位杂交显示miR-iab4也在腹神经索T3神经节高表达,并且发现两者均主要集中在VT006878神经元附近(图2)。进一步的研究表明,miR-iab4可能会影响神经元的功能,但是对神经形态可能没有影响。

图 2 Ubx蛋白及miR-iab-4 在果蝇中的表达分析

最后研究发现,Hox基因对神经生理和行为会有影响,这也是Hox基因在发育完成后(即发育为成熟个体)仍起调控作用的首次证据。因为之前一般认为,这类发育相关的基因可能只在生物发育过程中发挥重要作用。

基于以上实验数据,研究人员认为miR-iab4通过在果蝇T3神经节VT006878 运动神经元中,抑制其靶基因Ubx从而保证果蝇自行复位(翻身)这一正常的行为功能

   研究结果  

总之,该研究发现果蝇不同发育阶段的幼虫及成虫可通过由非编码miRNA和Hox组成的单个基因模块对等效的适应性行为运动进行调控。

研究提示,在不同的发育阶段,对于运动行为的调控可能会基于相同的遗传元件,但是该研究同时也指出 miR-iab4-Ubx遗传元件可能在果蝇的不同的发育阶段的不同身体部位的不同神经系统发挥功能。

因此,有必要进一步对类似的简单及更为完成的遗传元件在运动控制中所参与的分子环路调控网络进行更加深入的研究。

    总 结   

综上所述,本文应该是一篇值得神经学领域借鉴的研究。

首先,科研设计严谨。主要表现在作者基于在幼虫期发现miR-iab4/8对自行复位的影响,不仅在随后发育的各期对这一效应进行了验证,而且同时对恢复体位的能力和所需时间进行计算。除此之外,还特别评估了miR-iab4/8 对成年果蝇翻身复位的影响。进而,作者进一步评估了一般认为在运动中具有重要作用的足及在维持飞行稳定中的平衡棒对果蝇自身复位的贡献。

其次,研究步步深入。作者不仅从表型方面步步深入开展研究验证,如分别对前中后组在身体复位中的作用分别进行了验证,还从分子机制上对miR-iab4/8基因座所编码的两个miRNAs分别进行了验证,进而证明miR-iab4在果蝇复位中具有主要效应。作者基于对miR-iab4/8突变体是否会影响果蝇腿部运动的指标,进一步在分子机制上就其靶基因进行探索。在明确果蝇的足对翻身运动的贡献后,研究人员将后续研究聚焦到足部运动神经元,并通过实验验证相关分子的功能和神经组织定位(Ubx、miR-iab4)。并基于前面每一步的实验结果做出推论。

总体来看,本研究还是基于表型观察出发,通过分子机制的深入研究阐明microRNA-Hox在调控果蝇正常翻身中的作用。研究过程中涉及多方面的排除干扰或混杂因素影响实验结果准确性和严谨性的实验步骤,这也是本研究非常值得借鉴的一项内容。 目前主要研究方向集中在非编码RNA 及其相互结合的DNA、RNA、蛋白质等科学问题,而科学问题的解答依赖于实验技术的创新使用和实验设计的灵活巧妙。本研究就是非编码RNA在神经学研究领域的一个很好的案例。

参考文献

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  4. Picao-Osorio J, Johnston J, Landgraf M, et al. MicroRNA-encoded behavior in Drosophila[J]. Science, 2015, 350(6262): 815-820.

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