体细胞突变如何有助于溃疡性结肠炎发生?溃疡性结肠炎上皮细胞中体细胞突变图谱

机体内大多数组织需要不断自我更新以保持体内稳态,在自我更新过程中,体细胞不可避免地会产生突变【1】。测序可以检测到这些体细胞突变【2】。值得注意的是,这些突变基因常常与来源于同一组织的肿瘤驱动基因相重叠。遗传扰动研究提出概念:组织特异性体细胞突变或体细胞的进化,赋予细胞自主的自我更新能力,并促进了肿瘤发生。考虑到达尔文进化论中环境在驱动适应性形成的重要作用,那么有害环境的持续压力可能导致体细胞进化以非细胞自主的方式发生。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC是一种特发性慢性炎症性肠病,其特点是从直肠开始持续性炎症。长期存在的炎症是UC患者更易患结直肠癌,这表明UC的病理过程可能发生了体细胞进化,而且非肿瘤性UC上皮细胞中偶尔出现TP53的突变【3】。但是,UC上皮细胞在慢性炎症环境中是否重组其遗传图谱,目前还有待研究。

2019年12月19日,来自日本庆应大学医学院的Toshiro SatoNature杂志上发表文章Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium,通过对76个人结肠类器官进行全外显子测序,描绘出UC病人炎症性上皮细胞的体细胞突变图谱。炎症性上皮细胞积累了NFKBIZ、ZC3H12A、PIGR等多个IL-17信号相关基因的体细胞突变,CRISPR敲除筛选显示这些突变导致结肠类器官对IL-17A诱导的促凋亡产生抵抗,从而驱动IL-17A耐药性突变克隆的选择性扩增。

研究人员首先从55名UC病人(包括26名结肠炎相关的瘤变患者,colitis-associated Neoplasia,CAN)和16名健康对照中共培养出170份非肿瘤性结直肠类器官。为了在克隆水平上捕捉炎症相关突变,研究人员随后从UC患者和健康对照的单细胞中扩增克隆类器官,并进行全外显子测序。健康对照组上皮细胞中单核苷酸变异(single nucleotide variants,SNVs)的数量随年龄的增长而逐渐增加,与之前报道相一致。根据疾病和炎症状态将样品进一步分组,UCuninf(UC病人中没有炎症的组织)、UCinf without CAN(UC病人中有炎症,但没有CAN的组织)、UCinf with CAN(UC病人中既有炎症又发展为CAN的组织),而在年龄和疾病状态作为固定效应的线性混合模型中,3组间突变速率没有显著差异,SNVs数量与取样时内窥镜检测的疾病严重程度没有相关性。CAN患者的UCinf类器官中SNV数量与疾病持续时间呈正相关,而且其突变速率显著高于UCuninf类器官。通过比较累及脾曲远端结肠段UC患者的UCinf和UCuninf类器官中SNVs数量,显示UCinf类器官中SNVs数量显著高于UCuninf类器官,然而健康对照中左、右侧结肠的类器官中SNVs数量相当。UC炎症导致突变的整体数量增加,但并没有造成特异性突变特征。那么,UCinf类器官中是否存在功能性遗传变异?对无义突变、阅读框移动和剪接位点突变等截短突变进行分析,发现UCinf中重复出现NFKBIZ、PIGR两个与黏膜免疫相关的基因突变,这与基因组不稳定性相关。NFKBIZ截短突变的总数量明显高于其他截短突变。此外,NFKBIZ、PIGR的SNVs中非同义突变/同义突变的比例较高,显示出对非同义突变、蛋白质损伤突变的偏好。

研究发现UC相关的突变与IL-17通路相关。NFKBIZ编码蛋白IκBζ, 其被NF-κB信号上调,通过调控正反馈途径增强NF-κB的活化。PIGR是细胞表面分子,调节细胞的转胞吞作用和IgA的分泌,且IL-17相关NF-κB的活化上调PIGR。TRAF3IP2是IL-17受体的适配体蛋白,对下游NF-κB的激活非常重要。炎症UC上皮细胞中反复突变的基因集中在IL-17-NF-κB信号通路。同时,IL-17A刺激能够上调结肠类器官中NFKBIZ、PIGR和其他IL-17A经典靶基因CXCL1LCN2。对已发表的数据集进行分析显示,UC组织中NFKBIZ mRNA和其他IL-17A靶基因表达增加。值得注意的是,NFKBIZPIGR突变在CANs中非常少见或是杂合突变,表明这些基因的变异并不能诱导结肠炎相关的肿瘤生成的开始。短期培养多克隆UCinf、UCuninf和对照类器官,发现NFKBIZ和PIGR突变在UCinf中经常出现,而且在3个UCinf类器官中鉴定出5个IL17RA突变。过往的炎症对于UC相关突变的选择有重要作用。检测肠组织中PIGR的表达,发现PIGR普遍表达于健康和UCuninf上皮细胞,而UCinf组织由于PIGR突变出现局部性丢失,同时伴随着局部IgA分泌的缺失。UCinf类器官中鉴定出ZC3H12AS438LZC3H12AD437Y突变,ZC3H12A是IL-17应答的RNA结合蛋白,能够破坏NFKBIZ、IL17RA在内的炎症相关基因。其DSGXXS序列中S438位可被磷酸化,招募泛素化机器降解ZC3H12A蛋白,S438L突变破坏磷酸化过程,稳定ZC3H12A蛋白;D437Y突变为获得性突变,降低ZC3H12A对IL-17的应答。

最后,研究人员对IL-17信号通路是否对结肠上皮具有细胞毒性作用进行探究。利用CRISPR敲除筛选鉴定出在IL-17A选择过程其缺失导致生存优势的基因,IL17RA和NFKBIZ敲除促进细胞在IL-17A选择压力中生存;而PIGR缺失导致的生存选择并不直接由IL-17A细胞毒性介导,而是需要IgA相关的免疫应答;Noggin缺失导致类器官对IL-17A更加敏感。NFKBIZKOTRAF3IP2KOZC3H12AD437YTP53KO等都对IL-17A刺激产生耐受。这表明IL-17A信号对上皮细胞层是有害的,而有IL-17A通路突变的克隆可以规避IL-17A介导的细胞毒性,从而选择性地在受UC影响的组织中扩散。此外,UC组织中,IL-17A信号将iNOS和NO依赖的促凋亡信号传递到上皮表层,增加活化性caspase-3,激活凋亡通路,从而驱动IL-17A耐药性突变克隆的选择性扩增。

总的来说,本研究揭示了UC上皮细胞的基因图谱是如何适应有害环境,并且证明了体细胞突变如何有助于溃疡性结肠炎的病例发生,加深了我们对UC治病过程的理解,并有助于发现新的治疗靶点

原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1844-5

参考文献

1. Martincorena, I. & Campbell, P. J. Somatic mutation in cancer and normal cells. Science 349, 1483–1489 (2015).

2. Blokzijl, F. et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature 538, 260–264 (2016).

3. Brentnall, T. A. et al. Mutations in the p53 gene: an early marker of neoplastic progression in ulcerative colitis. Gastroenterology 107, 369–378 (1994).

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