基因敲入新策略:末端修饰双链DNA作为供体模板能有效提高编辑效率

随着科学技术卓越的发展,基因编辑技术作为能够研究和操控承载生命体特征的遗传单位——基因而被举世瞩目。CRISPR-Cas系统介导的基因编辑技术因其结构简单、编辑效率高以及成本低的优势成为研究基因治疗领域的得力助手。其中最为广泛使用的Cas9系统能够与单链向导RNA(sgRNA)产生复合体对靶向基因位点进行切割并且产生DNA双链断裂口(DSBs),随后通过非同源重组修复机制(NHEJ)对该DSBs诱导核酸的敲除或突变;或者在DNA供体模板(Donor template)的存在下通过同源重组修复机制(HDR)实现精准基因敲入。能够实现精准敲入的HDR机制被广泛研究, 但由于其在哺乳细胞,尤其是干细胞中敲入效率极低,使HDR在基因治疗中的实际应用受限。因此为了更大程度地挖掘基因敲入在生物技术中应用的可能性和潜力,研究者们非常迫切地需要更高效、安全且简便的敲入方法。
 
2019年12月23日,伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Huimin Zhao实验室在Nature Chemical Biology杂志上发表了题为 An efficient gene knock-in strategy using 5’-modified double-stranded DNA donors with short homology arms 的论文。该文章通过使用一种5’端化学修饰的双链DNA作为模板,结合了高稳定和低脱靶的Cas9核糖核蛋白(RNP),能够实现比未修饰情况下高出5倍的敲入效率 (图1) ,并且在人类胚胎肾脏细胞(HEK293T)中对长度为0.7kb的DNA片段实现了效率达到65%的敲入。研究者将只有50bp碱基长度的同源臂嵌入PCR引物中,通过简单PCR的过程实现了快速模板的制备,因此该策略不仅大幅度地提高了敲入效率也极大地缩短了体系的制备周期,给未来的基因编辑实验和基因治疗手段提供了更大的可能性。
 
图1.该策略的基因敲入基本流程
 
研究者首先选用了双链DNA作为模板, 而非传统技术中常用的质粒。质粒作为基因敲入模板,不仅制备周期长,且高浓度的导入会造成较强的细胞毒性。比较而言,双链DNA不仅能在几个小时内通过PCR制备完成,且在相同浓度下几乎不会造成细胞损伤。另外,由于Cas9蛋白与sgRNA在体外环境下先形成RNP复合体再导入细胞实现切割的方法在很多研究中已经证实了具有高效传递、高稳定性、低毒性以及低脱靶率等优点。因此研究者选用了这两种体系的结合。考虑到双链DNA在细胞内因极易被降解、且导入效率低会造成敲入效率的损失,该论文的研究者希望通过双链模板的末端修饰提高供体的稳定性,因此选择了13种化学基团对双链模板进行修饰,并且选用荧光报告片段敲入到HCT116细胞的GAPDH位点中进行筛选和效率测试(图2a)。结果发现所有的修饰均能够在不同程度上提高编辑效率,且化学基团C6-聚乙二醇(C6-PEG10)5’端修饰的模板能够得到比未修饰样品高出5-6倍的敲入效率 (图2c) 。由此,研究者得出双链模板的末端修饰能够极大提高敲入效率的结论。
 

图2. 采用体外合成Cas9-RNP和末端修饰的双链DNA供体的基因敲入策略。a. 基因敲入的报告体系。b. 该研究中所有修饰基团的化学结构。c. 2.2pmol浓度下的双链供体模板在HCT116细胞中的敲入效率对比。

 

随后研究者对该修饰(5’-C6-PEG10)体系的普适性进行了一系列的测试。发现在不同的细胞系、相同细胞系不同位点以及不同的RNP体系(Cpf1-RNP)中均有不同程度敲入效率的提高。普适性使该策略在未来基因治疗的应用中减少了更多的局限性,提高了被实现的可能性。在HEK293T细胞中的Lamin A/C位点使用该策略能够实现高达65%的敲入效率,这是之前研究数据在相同位点敲入相同片段效率的4.3倍之多。可以说,该敲入效率是目前基因敲入研究领域中从未达到的,这意味着无需后续阳性筛选即可高效率地得到单克隆细胞系。此外,该策略也可用于基因组上的长片段敲入 :2.5kb长度的片段在HEK293T细胞中AAVS1位点的效率可达40%。以及不同位点的同时敲入或者等位基因不同供体模板的同时敲入比未修饰样品均有3倍左右效率的提高,这些都能够佐证该策略在不同应用环境下的适用能力。
 
综上,Huimin Zhao实验室通过一种简单有效的基因敲入策略将Cas9-RNP以及5’端化学修饰的短同源臂双链模板进行结合,实现了高敲入效率、短实验周期、高安全性以及高精度的研究目的,具有很大的推广潜力,该策略不仅能够拓宽基因编辑技术在实际应用中的使用范围,更能够给该研究领域中基因编辑系统的进一步优化和临床实验提供了更加新颖的操作平台。
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41589-019-0432-1
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