ELISA和WB如何选择及ELISA实验过程中需要注意什么

近期实验室的大家都不约而同地拼搏在ELISA最前线,新来的小师妹看着这翻天覆地的场面,不禁问道,ELISA好做么?ELISA是不是什么蛋白都能检测?那能不能不跑WB了?面对这一番提问,突然觉得是时候整理一下关于ELISA的实验技能,以备大家不时之需!
 
首先ELISA是什么,相信只要本科医学的小伙伴们,就算不知道ELISA是干嘛的,也能答出来抗原抗体反应,ELISA就是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术

(图片来自网络)
 
一、那么接着一个重要的问题就是,ELISAWB如何选择
相信这个问题肯定很多人考虑过,其实我们选择的时候只要明白两个实验的优缺点就行。
 
首先,ELISA抗原抗体都能检测,而WB主要检测的就是抗原。对于ELISA主要的特点就是,使用的抗原或抗体是与某种酶连接成的酶标抗原或抗体,由于酶的催化效率很高,可以放大反应效果,增大检测的灵敏度,因此ELISA的检测限可以达到ng级,但WB显色敏感度一般在pg级。同时ELISA在保证实验稳定有效的前提下,是一个很好的定量实验。对于我们熟悉的WB实验,也有一个非常鲜明的优点就是,可以将不同大小的蛋白进行分离,根据目的蛋白的分子量大小预测位置进行检测,这样我们不仅能够知道检测的蛋白是否是多聚体、降解产物等,也能够同时检测不止一个目的蛋白。
 
同时我们也应该从样本和目的蛋白种类进行考虑,如果需要检测的目的蛋白是血浆或血清中的分泌蛋白,那么ELISA可能更适合,但是本人也曾使用WB实验检测出IL-6TNFα等分泌性炎症因子,所以,实验可能就是充满探究性!需要小伙伴根据自身情况考虑。
 
二、ELISA 实验过程中需要注意什么
1.       样本处理
首先对于ELISA来说,正确的处理样本是保证检测准确性和正确性的第一步。
正式实验之前最好使用少量的样本进行预实验,可以选择2510倍稀释样本,选择合适的稀释比例进行实验,亲身经历告诉大家,千万不能图省事,不然浓度太大超过检测限,简直就是赔了夫人又折兵!!!同时,样本的保存也非常重要,保存不当或在冰箱里保存过久的样本,血清中lgG可聚合成多聚体,导致结果偏高。建议五天内检测的血清样本可短暂存放4℃,一周之后测定的血清样本应该低温冻存,同时切忌反复冻融。如果是血清样本,也要主要样本不能有溶血、脂血和细菌等残留,这些样本中存在非特异性显色影响结果。

(图片来自网络)
 
2.       标准品如何使用
标准品的配置一般都是按照说明书进行的倍比稀释,很多厂家提供的盒子里标准品是冻干粉,同时要求每次使用新的冻干标准品那重复使用是否会有影响呢这里我又很有经历的含泪告诉大家,咨询过国产大牌的技术支持,建议是如果非用不可,那么标准品打开后一定要注意保存,且尽量不要相隔太久我也曾经试过,冬天放置一周的标准品,再次使用差别不大,但是放太久的标准品建议狠心丢掉,不要使用。因此小伙伴们设计实验一定要充分,尽量备好样本再进行操作!
 
3.       操作过程需牢记
  1. 首先,实验进行前要先将试剂盒从冰箱中恢复室温
  2. 加样时尽量将液体加入孔底,不要有气泡,提供一个小tip! 因为有气泡会影响吸光度值的测定,检测之前可以使用小枪头很容易戳破气泡。
  3. 洗板时注意不要间隔太久,尽量避免干板现象!
  4. 按照试剂盒批号和保质期使用,不同批次的试剂严禁混合使用,同时试剂盒使用后剩余的孔板一定要和干燥剂一起保存,防止潮湿。
  5. 目的蛋白含量低的样本可以咨询厂家是否可以适当延长孵育时间,使其充分结合。(本人使用不同厂家的试剂盒要求是不同的,有需要严格按照说明时间进行,防止非特异性结合,因此小伙伴们还是要多咨询一下!

(图片来自网络)
 
三、ELISA数据如何处理
首先我们都知道要做一个标准曲线,但是曾经小师妹直接做了一个二元一次方程还是惊到我了,那么ELISA的标准曲线是需要我们拟合曲线得到的,有很多软件都是可以直接帮助我们合成曲线并进行样本含量计算的,这里推荐大家几个良心好用的软件,ELISACalcoriginCurve ExertReaderFit等等。
最后,Elisa并不是简单的加样和检测,实验方法的选择也不是图省事,希望小伙伴们都轻松掌握,快乐实验,快乐发paper
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