文献解读:动脉粥样硬化怎么发10分以上的文章?

摘要

血小板衍生生长因子(PDGF)是血管平滑肌细胞(VSMCs)的有丝分裂原和趋化因子。然而,在动脉粥样硬化的背景下,PDGF受体b(PDGFRb)激活对血管平滑肌细胞的直接影响尚未被研究。在这里,我们提出了一种新的具有PDGFRb激活突变的动脉粥样硬化小鼠模型。PDGFRb信号增强诱导趋化因子分泌,导致白细胞聚集在主动脉外膜和中层。此外,PDGFRbD849V可放大和加速高胆固醇血症ApoE/或Ldlr/小鼠的动脉粥样硬化。有趣的是,PDGFRb信号增强促进了胸主动脉和冠状动脉新部位的高级斑块形成。然而,血管平滑肌细胞中PDGFRb激活的转录因子STAT1的缺失可以减轻动脉壁的炎症并减少斑块负荷。

研究结果

图1

图1:PDGF信号诱导血管平滑肌细胞释放趋化因子。

(A)激活VSMC中条件PDGFRbD849V等位基因的策略。条件性PDGFRbD849V等位基因由一个loxP侧翼终止盒组成,位于全长的小鼠PDGFRb互补DNA之前,并有一个针对PDGFRb基因的单一氨基酸取代(D849V)。当Sm22a-Cre转基因小鼠中存在条件等位基因时,VSMCs中的Stop被去除,PDGFRbD849V得以表达。SA,拼接受体。

(B)定量RT-PCR检测PDGFRbSm22D849V(b-D849V)突变小鼠和Sm22a-Cre(Wt)对照小鼠血管平滑肌细胞趋化因子mRNA水平的倍增变化。结果表明,突变体比对照增加了一倍,每个基因型有3个不同的VSMC分离株。

(C)用ELISA法测定VSMC培养上清液中分泌的趋化因子的数量,每个基因型有3个不同的VSMC分离株。

(D)用ELISA法测定突变小鼠和对照小鼠血浆中趋化因子的数量,每种基因型3只小鼠。

(E)定量RT-PCR检测10ng ml1 PDGF-BB配体作用于培养的Wt VSMCs后趋化因子mRNA水平的倍增变化。结果显示,经处理的细胞比未处理的对照细胞增加了一倍,即3个不同的VSMC分离株。所有数据均使用学生t检验进行评估,并以均值±S.E.M表示。*P<0.05;**P<0.01。

图2

图2:血管平滑肌细胞中的PDGF信号导致主动脉发炎。

(A)对PDGFRbSm22D849V(b-D849V)突变小鼠和Sm22a-Cre(Wt)对照小鼠酶解后的主动脉细胞进行流式细胞仪分析。数值数据显示CD45塔白细胞在所分析的全部细胞中所占的百分比。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性曲线图。

(B,C)用流式细胞术测量整个主动脉或分离的中膜和外膜中CD45塔白细胞的数量,每种类型的分析每种基因型有3只小鼠。

(D)用Masson‘s三色染色法测定白细胞(红色箭头)在胸主动脉中膜和外膜的分布。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性切片。比例尺,100 mm。

(E)用荧光标记抗体用流式细胞仪测定主动脉壁免疫细胞类型:APC-CD3;APC.Cy7-CD19;PE-CD11c;PE.Cy7-NK1.1;PerCy5.5-MAC1,每种基因型3只小鼠。

(F)用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹法检测培养的VSMC免疫沉淀后PDGFRb的磷酸化。PDGFRb-D849V酪氨酸激酶活性在细胞裂解前用PDGFR抑制剂Crenolanib(400ngml1)处理2h可被抑制。给出了两个实验的代表性印迹。

(G)用流式细胞仪检测PDGFRbSm22D849V突变小鼠全主动脉内CD45塔白细胞的数量。处死前连续5天给小鼠注射15 mg kg·1Crenolanib可使主动脉壁CD45塔白细胞减少,每次治疗3只小鼠。所有数据均使用学生t检验进行评估,并以均值±S.E.M表示。*P<0.05;**P<0.01。

图3

图3:PDGFRbSm22D849V突变小鼠具有结构性去分化的血管平滑肌细胞。

(A)免疫组化BrdU掺入法检测4周龄PDGFRbSm22D849V(b-D849V)突变小鼠和Sm22a-Cre(Wt)对照小鼠胸主动脉VSMCs增殖情况。数据表示每种基因型3个主动脉分支的血管平滑肌细胞的百分比。

(B)免疫荧光法检测4周龄小鼠胸主动脉中成熟VSMC标志物的表达,DAPI为核对抗染色法检测VSMC成熟标志物在4周龄小鼠胸主动脉中的表达。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性图像。比例尺,50 mm。

(C)以DAPI为核反染剂,用荧光标记法检测胶原1a1-EGFP转基因报告基因在突变小鼠或对照小鼠中的表达。对媒体进行了概述。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性图像。比例尺,50 mm。

(D)定量RT-PCR检测突变小鼠和对照小鼠培养的VSMCs细胞外基质蛋白mRNA水平的倍增变化。结果显示,突变体比对照增加了两倍,每个基因型有4个细胞分离株。

(E)用透射电镜观察2周龄突变小鼠和对照小鼠胸主动脉VSMC的超微结构。黑色箭头表示对照中的VSMC收缩束;开放箭头表示突变体中的粗面内质网;EL表示内皮;EL表示弹性片层。比例尺,50 nm。所有数据均使用学生t检验进行评估,并以均值±S.E.M表示。*P<0.05;**P<0.01。

图4

图4:PDGF信号增强高胆固醇血症小鼠的动脉粥样硬化。

(A)用En face Oil red O染色法检测ApoE、PDGFRbSm22D849V(ApoE/,b-D849V)突变体和ApoE/对照组16周后主动脉腔内动脉粥样硬化斑块的分布。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性图片。箭头表示ApoE对照中的主动脉弓斑块。比例尺,5毫米。

(B)采用油红O染色切片,观察WD 16周后主动脉根部斑块的分布情况,并给出各基因型主动脉根部3个斑块的代表性图片。NC,坏死核。比例尺,500毫米。

(C,D)在指定时间内饲喂WD(C)或日粮(D)的小鼠主动脉根部、主动脉弓、头臂动脉(BCA)和胸主动脉斑块横截面积的定量,每个时间点每个基因型10只小鼠;*每个时间点突变小鼠与对照小鼠的比较采用学生t检验P<0.01。

(E)Ldlr、PDGFRbSm22D849V(Ldlr/,b-D849V)突变体和Ldlr/对照WD 16周后,采用En face Oil red O染色法检测主动脉腔粥样硬化斑块的分布。图中显示了每种基因型的三条主动脉的代表性图片。比例尺,5毫米。

(F)用油红O染色切片,观察WD 16周后主动脉根部斑块的分布情况,并给出各基因型主动脉根部6个斑块的代表性图片。比例尺,500毫米。

(G)主动脉根部斑块横截面积的定量,每种基因型6根;*P<0.01经学生t检验。所有数据均表示平均值±S.E.M。

图5

图5:斑块起始、进展为纤维动脉粥样硬化瘤和斑块内出血。

(A)观察ApoE、PDGFRbSm22D849V(ApoE/,b-D849V)突变小鼠和ApoE/对照小鼠在WD 6周后胸主动脉斑块的形成,方法是用苏木精和曙红(顶板)染色主动脉横断面或用荧光抗体鉴定VSMCs(ASMA,绿色)和巨噬细胞泡沫细胞(MOMA-2,红色)。

(B,C)ApoE、PDGFRbSm22D849V小鼠WD后8周(B)或24周(C)胸主动脉斑块进展的组织学分析。显示的是低倍图(上图)和高倍图的盒状区域(下图),它们代表了每个时间点分析的至少6个变异主动脉。白色箭头表示泡沫细胞,黑色箭头表示纤维帽,nC4坏死核心。比例尺,100 mm。

(D,E)16周或24周WD后ApoE、PDGFRbSm22D849V小鼠进展期斑块的组织学分析。(D)Movat‘s五色染色(16周Wd)或(E)Masson’s三色染色(24周Wd)。比例尺,125 mm。

(F)WD 16周后原位观察ApoE、PDGFRbSm22D849V胸主动脉三个部位出血(箭头)的数码照片。在拍照之前,老鼠通过心脏灌注,主动脉的脂肪组织被清除。

(G,H)斑块内破裂的组织学分析:(G)苏木精-伊红或(H)普鲁士蓝和核牢牢红,以显示斑块内出血,没有纤维帽破裂的证据。比例尺,100 mm。

(I)WD 16周后,对突变和ApoE对照的胸主动脉内皮细胞进行免疫荧光分析。图中显示了PECAM染色的典型图像。箭头表示突变斑块中的新血管。比例尺,100 mm。

结论

这些结果表明PDGFRb通路的激活在血管疾病中有深远的影响,并支持外动脉层炎症是动脉粥样硬化的驱动过程的结论。

DOI:10.1038/ncomms8770

参考文献

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