脑微血管的分离与分子鉴定

脑血管内皮细胞与周细胞、血管平滑肌细胞和胶质细胞协同形成物理、运输和代谢屏障(blood brain barrier, BBB),维持抗凝和抗炎状态,并调节微循环流量,以满足神经元需求和维持内环境平衡。
 
脑微血管(Cerebral microvessels)与脑实质的病理过程紧密联系在一起,因此脑微血管的研究日益重要,例如中风,脓毒症,创伤性脑损伤和神经退行性疾病等。然而在上述疾病中脑微血管功能障碍的分子机制在很大程度上是未知的!

 

由于缺乏可重复的分离具有一致细胞成分的完整脑微血管的标准化方法,从而阻碍了实验性疾病模型中脑微血管的分子机制的研究。今天半夏就给大家分享一篇2019年10月4日发表在Nature Protocols(IF: 11.3)上的脑微血管的分离与分子鉴定的文章并总结了一些脑微血管分离的经典方法!
大脑皮质微血管分离步骤
 
注意:所有分离过程均于冷室进行。
 
1. 将小鼠置于CO2室中2-3分钟后进行颈椎脱位处死,然后立即将小鼠带到冷藏室。
2. 小心取出大脑并立即将其转移到含有MCDB131培养基的培养皿中冲洗大脑。需确保整个大脑浸泡在培养基中。
注意:一旦小鼠被安乐死RNA就开始降解。一次在一只小鼠上执行步骤1和2,并将大脑保存在冰上预冷的MCDB131培养基中,直到整个组处理完毕。
3. 使用镊子轻轻将大脑均匀的在吸水纸上滚动以去除脑膜和脑膜血管。将大脑置于DPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline),解剖时DPBS比MCDB131培养基可见度更高。
4. 使用剃须刀片将大脑矢状切片并去除小脑。
5. 进一步移除所有深部脑结构,包括海马和残余白质来分离皮质,小心避免损伤皮质。虽然大部分脑深部结构应该被尽可能地去除,但仍然会有一些白质可能附着在皮层上。不要试图以损伤皮质为代价来移除所有的白质组织,这将在后续的步骤中被去除。
注意:如果不能立即进行下一步,请将分离的皮层放在MCDB131培养基中的冰(4°C)上,但不要将分离的皮层停留超过15分钟。
 
6. 在1ml的MCDB131培养基中以稳定的速度使用松散的7ml的Dounce型组织研磨机进行上下匀浆(注意上图箭头),不转动杵。
7. 向步骤6匀浆中加入7ml的MCDB131培养基(共8ml培养基)并进行另外两次上下匀浆。
8. 将匀浆液倒入14ml的圆底离心管中,注意添加MCDB131配平离心管。
9. 4°C 2000g离心5分钟,倒出上清液并将倒置的离心管放在纸巾上,以吸收附着在侧面的多余的培养基或碎片。
 
10. 使用15%(wt/vol)右旋糖酐-DPBS中重悬沉淀。为了均匀的分散沉淀先从管子的侧面轻轻的加入1ml 15%(wt/vol)的右旋糖酐溶液冲洗侧壁,进行5-6次重悬,然后再加入7毫升15%(wt/vol)的右旋糖酐溶液。
11. 4°C 10000g离心15分钟,会出现红色的含有微血管的沉淀。
注意:如果沉淀看起来不是干净的红色,则表明受到白质、髓鞘或组织碎片的污染。
 
12. 小心弃去上清液,以避免污染沉淀。
13. 用1ml DPBS取出沉淀。将沉淀从管子的侧面排出,并将其吸入枪头尖端。该过程不鼓励使用超过1ml的DPBS。管壁上存在一些碎片,这些碎片可以很容易地被吸液吸走,使用小体积有利于最小化污染。
14. 将沉淀转移到40μm细胞滤器中,用<10ml的DPBS冲洗沉淀。本步骤旨在去除微血管上轻微粘附的匀浆碎片以及去除松散的碎片。
注意:根据下游应用的不同,有可能需要在此步骤之后立即直接进入步骤18。
15. 使用含有0.5%(wt/vol)不含脂肪酸、蛋白酶和内毒素的BSA的MCDB131培养基10-20ml反转滤器回收微血管。
16. 为了通过显微镜方法快速评估微血管的纯度,从步骤15取50µl微血管悬浮液,将其平板化到35 mm培养皿中,并在室温下放置5分钟在倒置显微镜下进行观察。
17. 4°C 5000g离心10分钟,此步骤将得到最终的微血管沉淀。
分离微血管纯度的鉴定
 
通过神经元标记TUJ1来评估微血管制剂的纯度,结果显示了全脑和微血管样本中微血管组分中无TUJ1的表达:
 
进一步测量了约1000个微血管片段的直径,发现85.3%的微血管直径<5µm,8%的微血管直径在5-10µm之间,6.7%的微血管直径>10µm。作者还测定微血管的细胞组成:通过RT-qPCR定量Tjp1(ZO-1,内皮标记物),Aqp4(星形胶质细胞终足标记物)和Anpep(CD13,周细胞标记物)mRNA水平来评估微血管组成细胞类型中内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的含量:
 
分离微血管的形态特征及细胞组成
 
分离微血管结构完整,表达了内皮标记物(CD31)、星形胶质细胞终足标记物(Aqp4)、周细胞 (PDGFRβ)和平滑肌细胞标记物(SMA):
 

 

前毛细血管动脉为α-SMA+,α-SMA-为毛细血管。直径<5µm的脑微血管均为毛细血管,直径>10µm 100%均为前毛细血管动脉,而≤10µm的微血管中仅有8%为前毛细血管动脉:
 
最后给大家附上Troubleshooting:
 
其他脑血管分离纯化方法
 
一、Purification of Mouse Brain Vessels
 
早在2015年视频化期刊Journal of Visualized Experiments(JOVE)发表了一篇 “Purification of Mouse Brain Vessels”的方法,视频链接为:
https://www.jove.com/video/53208/ 
 
Agrin为基膜蛋白,ZO1为紧密连接蛋白,NG2标记血管周细胞(Pericyte),SMA标记血管平滑肌肌动蛋白。使用上述抗体标记分离脑血管,其分离血管效果如下:
 
该分离方法溶液配制表如下:
 
分离步骤如下:
 

 

二、冷蔗糖缓冲液提取脑微血管
 
2015年Brain文章涉及脑微血管分离示意图:
 
 
详细步骤:
 
和Nature Protocols鉴定相似,作者使用了血管内皮细胞的Marker CD31(即PECAM1)与Von Willebrand Factor,周细胞的Marker PDGFRβ:
 
此外,Western blot鉴定脑匀浆液(Brain Homogenate,  BH)、上清液(Supernatant, S,主要为神经细胞相关组分)和提取微血管(Vasculature, V),微血管组分表达血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)与PECAM(血管内皮细胞Marker)而不表达神经细胞标志物Synaptophysin,相反BH和S不表达eNOS、PECAM而表达Synaptophysin,说明分离微血管纯度较好:
 
三、免疫磁珠法分离脑微血管
 
正巧也是2015年, Circulation (IF:18.88)使用CD31免疫磁珠分离脑微血管细胞群。具体步骤为麻醉处死动物后分离脑组织,利用木瓜蛋白酶神经组织分离试剂盒Papain Neural Tissue Dissociation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 分解组织。950g离心去除髓磷脂后重悬细胞沉淀使用CD31磁珠流式分选CD31富集元素。
 
Caveolin1(Cav1)主要分布于血管内皮细胞与血管平滑肌细胞,Caveolin1免疫荧光表明免疫磁珠法富集的主要成分为血管组分。
 

 

今天脑微血管分离方法分享就到此结束,希望对大家有所帮助!

 

参考文献:

1. Lee YK, Uchida H, Smith H, Ito A, Sanchez T. The isolation and molecular characterization of cerebral microvessels. Nat Protoc. 2019.

2. Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

3. Bales, K. R., O’Neill, S. M., Pozdnyakov, N., Pan, F., Caouette, D., Pi, Y., … Samad, T. A. (2015). Passive immunotherapy targeting amyloid-β reduces cerebral amyloid angiopathy and improves vascular reactivity. Brain, 139(2), 563–577. doi:10.1093/brain/awv313.

4. Hoffmann CJ , Harms U 1, Rex A , Szulzewsky F , Wolf SA , Grittner U , Lättig-Tünnemann G  …(2015) Vascular signal transducer and activator of transcription-3 promotes angiogenesis and neuroplasticity long-term after stroke. Circulation , May 19;131(20):1772-82.

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