文献解读:肿瘤源性细胞与血脑屏障的关联

摘要

血−脑屏障的限制性给脑部给药带来了巨大的挑战,目前的纳米药物缺乏穿越血脑屏障的能力。细胞外小泡(EVS)在包括脑转移癌在内的多种脑部疾病的发生发展中起重要作用,被认为是一种很有前途的治疗药物和药物载体。然而,天然肿瘤来源的EVS突破血脑屏障的能力和这一过程中涉及的机制仍不清楚。

研究结果

图1

图1:促进脑转移的乳腺癌EVS突破了血脑屏障。

(A)从亲代和寻脑的MDA-MB-231乳腺癌细胞(分别为P-EV和BR-EV)分离的EV的电子显微镜图像。

(B)描述体内脑转移研究设计的示意图。

(C)每个脑转移瘤的平均表面积(平均±SD;n=7只/组)。统计分析采用Mann-−-Whitney检验。

(D)具有代表性的脑转移瘤的H&E图像。所有转移瘤均表现为血管选择性生长(黑色箭头)。标尺,50μm。

(E)代表性荧光显微镜图像(×200)和(F)通过血脑屏障成分体外摄取TdTomEV的定量(均值±SD;3个独立实验)。统计分析采用双因素方差分析和Sidak多重比较检验。

(G)电动汽车配电研究设计示意图。

(H)接受眼眶后注射TdTom-BR-EVs的小鼠脑切片的抗GFAP免疫染色(绿色)的两张代表性荧光图像(红色)。箭头显示星形胶质细胞(×400,n=3)摄取BR-EVS。

(I)注射PBS或BR-EV+10 kDa Alexa647葡聚糖和70 kDa FITC葡聚糖后45min采集脑组织匀浆的平均荧光强度(平均±SD;n=3只/组)。统计分析采用Mann-−-Whitney检验。在所有面板中,ns=不显著;*P≤0.001;**P≤0.01;*P≤0.001。

 

图2

图2:BR-EVS通过细胞穿透穿过脑内皮细胞。

(A)Transwell BBB模型腔室介质中的发光信号在温度和(B)内吞抑制作用下的倍增变化(均值±SD;3个独立实验)。统计分析采用(A)非配对双尾学生t检验和(B)单因素方差分析和Tukey多重比较检验。

(C)BR-EVS和VEGF(阳性对照)对内皮单层对10 kDa和70 kDa右旋糖酐通透系数的影响(均值±SD;3个独立实验)。统计分析采用双因素方差分析和Sidak多重比较检验。

(D)来自清洗室的介质的密度梯度部分的发光强度的倍增变化。将发光信号归一化为不含EVS的30%组分的发光信号。15%和25%组分相当于1.105−1.184 g/mL的EV密度(平均值±SD;3个独立实验)。

(E)体外BBB芯片腔道内荧光信号随时间的增加(Mean±SD;3个独立实验)。统计分析采用非配对t检验和Welch‘s校正。

(F)BR-EVS对BBB模型对10 kDa和70 kDa葡聚糖通透性的影响(Mean±SD;3个独立实验)。统计分析采用双因素方差分析和Sidak多重比较检验。

(G)BBB-on-a-Chip模型中内皮细胞(左图)和星形胶质细胞(右图)拍摄的TdTom-BR-EVs的荧光显微镜图像。(h,上图)EV注射后1小时,斑马鱼大脑的典型荧光图像(由黑色方块选择的区域)。白色箭头显示脑实质内的EVS。(H,下图)含BR-EV的内吞囊泡(白色箭头)与内皮开通质膜相互作用的时间推移图像(3个独立实验)。

(i) 斑马鱼脑血管系统中右旋糖酐分布的代表性荧光图像。

(j) 注射右旋糖酐后斑马鱼脑组织中血管内与血管外荧光强度的比值(均数±标准差;10kDa右旋糖酐,每组11条鱼;70 kDa右旋糖酐,每组14 条鱼;3个独立实验组合)。采用双因素方差分析和 Sidak 多重比较检验进行统计学分析。在所有组,ns=不显著;*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001;****P≤0.0001。

图3

图3:Br-EV转胞吞作用涉及小窝蛋白非依赖性胞吞作用、再循环内涵体和基底外侧陷阱。

(a) 流式细胞术定量检测不同胞吞作用途径化学抑制剂存在时脑内皮细胞对TdTom-Br-EV的摄取(均数±标准差;3个独立实验)。使用非配对双尾 Student t检验进行统计分析。

(b) 来自3个独立实验的TdTom-Br-EVs与70 kDa FITC葡聚糖(巨胞饮标志物,左图)和 Alexa647转铁蛋白(网格蛋白依赖性胞吞标志物,右图)共区域化的代表性荧光显微图像。底部面板显示白色方块所选区域的放大倍率。白色箭头表示共区域化。比例尺,25 μm。TdTom-Br-EVs 与 (c) rab 11, (d)DQ-卵白蛋白,(f)VAMP-3, 和 (g)VAMP-7共区域化的典型荧光显微图像。右图显示的是白色方块区域的放大倍数。白色箭头表示共区域化。比例尺,25μm。rab11、DQ-卵白蛋白(e)和VAMP-3和VAMP-7 (h) 共定位的含 Br-EV 囊泡的百分比定量(平均值±SD;3 次独立实验)。使用非配对双尾 Student’s t 检验进行统计分析。

(i,j) 来自3个独立实验的TdTom-Br-EVs与突触融合蛋白4(i)和Snap23(j)共区域化的代表性荧光显微图像。右侧面板显示白色方块选定区域的放大倍率。白色箭头表示共区域化。比例尺,25μm。在所有组,ns=不显著;*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

图4

图4:Br-EVs下调内皮Rab7以促进其转运。

(a−c) Western blot图像和体外EVs处理后脑内皮细胞中Rab7和rab11表达的定量(均数±标准差;3个独立实验重复)。使用单因素ANOVA和 Tukey多重比较检验进行统计学分析。

(e)代表性荧光显微镜图像和脑内皮细胞中 rab7 KD对DQ-卵清蛋白转移至溶酶体降解(中图)和 LAMP1溶酶体标志物表达(下图)影响的定量(mean±SD;3个独立实验)。比例尺,25 μm。统计分析采用非配对双尾 Student’s t 检验。

(f) 脑内皮细胞中rab7敲除的Western blot图像。

(g)伴或不伴rab7 KD的脑内皮细胞TdTom-Br-EV 摄取量的流式细胞术定量(均数±标准差;3 个独立实验)。采用非配对双尾 Student’s t 检验进行统计分析。

(h)rab7 KD脑内皮细胞摄取TdTom-Br-EV的代表性荧光显微图像和(i)含Br-EV内体囊泡大小的定量(平均值±SD;3个独立实验)。比例尺,25 μm。采用非配对双尾 Student t 检验进行统计分析。在所有组,ns=不显著;*P≤0.05;**P≤0.01;***P≤0.001。

结论

我们进一步确定并描述了肿瘤来源的EVs通过降低rab7的脑内皮表达并提高其转运效率来规避血脑屏障中细胞转运的低生理速率的机制。这些发现确定了以前未知的肿瘤来源的EVs在脑转移过程中破坏完整血脑屏障的机制,并可用于指导和指导药物递送方法的发展,以递送治疗性货物穿过血脑屏障治疗各种脑疾病,包括,但不限于脑部恶性肿瘤。

DOI:10.1021/acsnano.9b04397

参考文献

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