文献解读:利用DNA甲基化(DNAm)来识别CPC的预后表观生物标记

脉络神经丛肿瘤(CPT)的组织学分级仍然是区分侵袭性脉络神经丛癌(CPC)和较良性脉络神经丛乳头状瘤(CPP)或非典型脉络丛神经乳头状瘤(aCPP)的最佳预后工具;但是,这些区别可能具有挑战性。CPC的标准治疗方法非常激进,通常会严重损害幼儿的大脑。因此,至关重要的是区分CPC和攻击性较弱的实体(CPP或aCPP),以避免年轻患者不必要地接受神经毒性治疗。为了更好地对CPT进行分层,作者利用DNA甲基化(DNAm)来识别CPC的预后表观生物标记。

 

 

材料和方法

1)患者,组织和样品制备:作者从两个大型的儿科神经肿瘤学中心获得了肿瘤样本和临床数据。由C. Hawkins博士进行CPT的病理学检查。专家神经病理学家均严格检查每个病例。从新鲜速冻(n = 53)或福尔马林固定石蜡包埋肿瘤样品中分离DNA。使用标准苯酚-氯仿从新鲜冷冻样品中提取肿瘤DNA。该研究共涉及34个样本,包括15个CPP,5个aCPP和14个CPC。另一个验证队列包括22个样本,包括4个CPP,3aCPP和15个CPC。还使用了来自德国明斯特大学神经病理学的61个CPT的复制队列进行测试。

2)TP53基因测序:通过直接Sanger测序对TP53的编码区进行测序。

3)DNA甲基化:可通过GEO获得所有34个主要样品的全基因组DNAm图谱,登录号GSE61044。

4)全基因组DNA甲基化分析:使用IlluminaGenome Studio分析软件分析了HumanMethylation450阵列产生的数据,筛选探针后保留了414319 CpG甲基化位点以供进一步分析。使用Illumina注释将CpG位点映射到调控基因组区域。在每个CpG探针上使用了非参数Mann Whitney U检验来识别癌和乳头瘤之间差异甲基化的位点。应用FDR矫正后p<0.001以及平均甲基化差异Δβ≥40%来筛选生物标志物。

5)CPC特异signature的预测建模:使用Weka机器学习方法ww.cs.waikato.ac.nz/ml/weka)和R包caret进行了预测分析。

6)多元因子分析:使用34个样本队列和61个复制队列(35CPC,33 CPP,27aCPP)的组合数据集的95 CPT样本对DNAm水平以及其他样本基因型和表型属性进行了多因素分析以确定它们之间可能的对应关系。

7)验证被选为生物标志物的差异甲基化CpG位点(焦磷酸测序分析):选择了三个基因作为生物标志物,它们证明了CPC和CPP之间最大程度的分离,并使用34个样本的测试集和22个样本的验证集对相应CpG位点的这些肿瘤组之间的甲基化差异进行了验证。

8)生存分析:使用Kaplan-Meier方法进行生存分析。

 

主要结果展示

(1)CPCs甲基化特征及TP53突变群的识别:作者对主要CPT的全基因组DNAm的分析,结果显示CPP和aCPP之间的不存在显著差异,但是CPC和CPP或aCPP之间的CpG甲基化谱存在显著差异。尽管CPP和aCPP之间的全基因组DNAm没有显著差异,但与CPP相比,存在CPC特异性标记。作者一共确定了CPC和CPP之间的甲基化存在显著差异的3361个CpG探针。利用Pearson相关和平均连锁对样本树和基因树进行的双向聚类显示大部分CPC(86%)在CPC和CPP或aCPP之间存在分离(图1)。由于超过50%的CPC肿瘤携带体细胞TP53突变,并且TP53突变CPC的预后不良,因此作者试图确定CPC组内观察到的聚类是否与TP53突变状态相关。结果显示,含有TP53纯合子突变的CPC聚为一组,与携带杂合子TP53突变的CPC或具有TP53-wt的CPC分开(图1A,B)。

图1.使用Pearson相关和平均连锁对34个CPT样本进行双向聚类

 

接下来作者对CPT进行生存分析(图2),结果显示甲基化组1和2仅包含CPC样本,而甲基化组3则主要包含CPPs或aCPPs,并且具有没有死亡事件。与仅包含具有杂合TP53突变或TP53-wt的CPC的甲基化组2相比,仅包含具有纯合TP53突变的CPC的甲基化组1的预后特别差。

 

图2.Kaplan–Meier(KM)曲线描绘了甲基化亚组对CPT患者的总体生存(OS)估计

 

(2)甲基化差异基因的通路和生物学功能分析:为了研究受CPC中DNAm改变影响的基因是否倾向于落入特定的分子通路,作者使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对与3361个CpG探针重叠的1328个基因组进行了通路分析。与CPP相比确定了CPC中显著富集的9条通路(图3A)。IPA生物功能分析显示54个功能类别在CPC中发生了显著变化。CPCs中最富集的类别与细胞发育,细胞生长和增殖,癌症,细胞死亡和生存以及细胞组装和组织有关(图3B)。

图3.条形图显示了富集的通路

 

(3)DNA甲基化与基因表达之间的相关性:为了评估差异甲基化对基因表达的影响,作者检查了以前使用Affymetrix Exon1微阵列分析的40个CPT数据集中的3361个CpG位点。作者从该研究中鉴定了26个具有可用的表达谱数据的样本,包括11个CPC,12个CPP和4个aCPP。应用FDR校正的p值<0.05确定CPC和CPP之间的差异表达的基因。鉴定了57个单基因,这些单基因显示CPC之间的甲基化和表达水平之间的相关性。其中32个基因在其启动子区域表现出差异甲基化并与CPC中的表达呈负相关(图4A)。同时,25个基因的探针在基因体内表现出差异甲基化并且与表达呈正相关(图4B)。

图4.甲基化和基因表达之间的相关性

 

(4)CPC特异性DNA甲基化标记:作者进一步提高了差异甲基化严格度(FDR校正后p值<0.001,Δβ大于0.4),这样提取了59个包含33个候选基因的高置信度差异甲基化CpG位点(图5)。

图5.34个CPT样本的CPC特异性DNA甲基化特征热图和PCA

 

(5)使用外部数据集测试CPCDNA甲基化标记的特异性:为了进一步验证CPC生物标记物签名的特异性,作者从GEO数据库以及TCGA中提取了可公开获得的儿科脑肿瘤DNAm数据集并与该研究中的的CPT甲基化数据一起对其进行了分析。提取的数据与该研究中的CPT数据相结合,所有样本仅限于包含CPC特异性特征的CpGs,并使用层次聚类法检查CPT与其他脑肿瘤的分离(图6)。层次聚类的热图显示了CPC的不同DNAm模式。此外,CPC与大多数其他脑肿瘤分开,进一步证实了CPC DNAm标记的高度特异性(图6)。

图6.GEO和TCGA数据库中具有CPC特异性DNA甲基化特征的脑肿瘤DNA甲基化数据集的热图

 

(6)使用CPT肿瘤复制队列测试CPCDNA甲基化标记的敏感性:作者将CPC特定的DNAm特征应用于最近发表的一项研究中的一系列CPT。该队列由21个CPC,22aCPP和18CPP组成。使用此复制数据集,CPC聚集在一起并与CPP分开。这表明在正确将组织病理学特征分配给CPT时,CPC特异性DNAm标记具有很高的敏感性(图7a)。此外,作者想检查该CPC特定DNAm特征在根据复制队列对aCPP进行分类时的敏感性。第一个甲基化簇包括预期的大多数CPP(簇1)和一些aCPP。第二个簇分为两个子集(2A和2B),其中一个子集主要是CPC(2B),而另一个自己(2A)则是从组织学角度定义的CPC,CPP和aCPP的组合(图7b)。

图7.在应用CPC特定的DNA甲基化标记后,从CPT复制数据集中获得的DNA甲基化谱图

 

从复制队列中,对每个组织学定义的CPP和aCPP组分别进行分层聚类,能够根据其DNAm谱清晰地区分每个CPP和aCPP组中的一个子集。接下来,作者结合来自两个队列的样本,以基于CPC特有的特征生成DNAm谱(图8A)。基于分子定义簇内95个组织学定义的CPC,CPP和aCPP样本的分布,作者还研究了死亡或复发事件的发生频率。每个分子定义的组中死亡事件的发生频率(图8B)都非常不同。第1组的复发频率为5%(图8C),第2B组为61%,第2A组仅为17%。CPC中的死亡事件为28.1%,CPPs或aCPPs中的死亡事件为0%(图8d),而复发的频率比基于DNAm簇的预测的发生率低12.9%(图8e)。

图8

 

结论:DNA甲基化谱分析可将CPTs细分为3个疾病亚组,而CPC特有的DNAm标记的整合可显著改善预后风险的预测,从而可做出明智的治疗决策,从而保护一些年轻患者免于由不同原因造成的破坏性和永久性神经系统的损害。

5.参考文献

1.Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, et al. The2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. ActaNeuropathol. 2007;114(2):97–109.

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4.Fitzpatrick LK, Aronson LJ. Cohen KJ. Is there a requirement for adjuvanttherapy for choroid plexus carcinoma that has been completely resected?JNeurooncol. 2002;57(2):123–6.

5.Wrede B, Liu P, Wolff JE. Chemotherapy improves the survival of patients withchoroid plexus carcinoma: a meta-analysis of individual cases with choroidplexus tumors. J Neurooncol. 2007;85(3):345–51.

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