细胞培养方法(十一):流式细胞术鉴定表面抗原

流式细胞术鉴定表面抗原

1实验方法
1.用6孔板培养细胞,待细胞生长达到60%-70%,弃掉旧培养基。收集对应细胞培养基到一离心管内备用。

2.用0.25%胰酶消化细胞,至细胞变圆,加入前面收集的细胞培养基,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞,收集到离心管内(注意:悬浮细胞不需要胰酶消化,直接收集到离心管即可)。

3.200g离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

4.小心吸去上清,可以残留约50μl的培养基。

5.加入约1ml预冷的PBS,重悬细胞,并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞,小心吸去上清,可以残留约50μl PBS。

6.轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

7.在每个流式检测管或板式微孔中加入50μl的稀释后的抗体(抗体用Staining Buffer稀释成合适的浓度);在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50μl Staining Buffer。若进行抗体最佳浓度测试,建议范围2-0.03μg/106细胞。

8.在各管/孔中分别加入50μl细胞悬液(约106细胞),并轻轻混匀。

9.避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20min。孵育完成后,加入Staining Buffer(每流式检测管中加2ml,而每微孔中加200μl)。

10.200g 4℃离心5min,并弃去上清,重复洗涤过程3次。100μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。

2结果示例及分析

 

 

  如上图中,

左上象限Q1代表CD44标记的细胞

右上象限Q2代表CD34和CD44共同标记上的细胞

右下象限Q3为CD34标记的细胞

左下象限Q4为未被标记的细胞。

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