基于网络药理学探讨黄芪治疗糖尿病肾病作用机制

 要:目的  利用网络药理学方法研究黄芪治疗糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法 以化合物的口服生物利用度(OB)和类药性(DL)为标准,依据中药药理学技术平台(TCMSP)数据库、小分子靶点预测平台(SwissTargetPrediction)、人类基因组注释数据库(Genecards)预测和筛选黄芪的活性成分及治疗DN的作用靶点。采用Metascape数据库对作用靶点的基因本体(GO)注释和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路进行富集分析和蛋白功能归属。结果 从黄芪中筛选得到槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花素、黄芪皂苷I~IV等24个活性成分,作用于172个DN靶点,筛选出表皮生长因子受体、血管内皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等18个关键靶点。调节晚期糖基化终末产物及其受体(AGEs-RAGE)介导的信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/叉头框转录因子OPI3K/Akt/FoxO)信号通路、核转录因子κBNF-κB)信号通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活因子信号通路等关键代谢通路。参与物质代谢、氧化还原、信号转导、炎症反应等多种生物过程。结论  黄芪及其活性成分通过多个靶点、多条通路发挥治疗DN的作用。

糖尿病肾病(diabeticnephropathyDN)是糖尿病的重要并发症之一。DN的发生、进展与慢性炎症反应、氧化应激、糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变等多种因素相关。相关研究显示,中医药DN的治疗中发挥着独特的作用。基于关联规则和因子分析,对治疗DN中药组方规律的研究[1]显示,黄芪Astragali Radix为使用次数最多的中药。黄芪的药用迄今已有2 000多年的历史,有增强机体免疫功能、利尿、抗应激、降压等作用[2]。近年来,大量研究[3]表明黄芪及黄芪经方对DN的治疗有积极的作用,可明显改善患者症状,降低尿蛋白,改善肾功能,但黄芪治疗DN的物质基础及作用机制仍不清楚。因此,本研究采用网络药理学的研究策略,对黄芪主要化学成分及其治疗DN的作用机制进行较全面系统地分析,为后续研究提供一定的理论基础。

1  资料与方法

1.1  主要化学成分的收集与筛选

利用TCMSP数据库[4]http://ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsp.php)收集黄芪的主要化学成分;根据化合物药动学参数中口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18的标准[5],并结合文献报道筛选出候选化合物。

1.2  药物作用靶点的筛选

通过TCMSP检索候选化合物靶点,将候选化合物靶点通过蛋白质数据库(UniProt)中的UniProtKB搜索功能转化为相应基因。利用Swiss TargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction. ch/)平台,预测候选化合物的潜在靶点。将2个数据库检索到的化合物靶点合并,删除重复基因,即得药物作用靶点基因。

1.3  黄芪治疗DN的靶点搜集

Genecards数据库中输入关键词“diabetic nephropathy”,得到DN相关靶基因。利用比较毒物遗传性数据库(CTD)的检索功能,在“Diseases”中输入“diabetic nephropathy”,点击“Gene”项,即可找出与DN相关联的所有基因,选取以“M”标识代表经过实验验证的基因。将2个数据库的基因整合,去除重复项得到DN相关基因。将DN靶基因与药物作用靶点基因映射筛选,找出两者的交集基因,得到黄芪治疗DN的潜在靶点。

1.4  网络的构建与分析

1.4.1  成分靶点网络的构建  采用Cytoscape 3.7.1软件构建黄芪治疗DN的成分靶点网络。在该网络中,节点代表化合物、靶蛋白,边代表化合物靶点的相互作用。采用Cytoscape3.7.1软件中的“Networkanalyzer”功能,对网络的拓扑属性进行分析,计算节点连接度(degree)、节点介度(betweenness)和节点紧密度(closeness3个重要网络拓扑参数[4]。最后利用网络拓扑属性分析黄芪治疗DN的主要活性成分。

1.4.2  靶蛋白相互作用(PPI)网络的构建  STRING平台构建靶蛋白PPI网络,物种设为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值设为中等置信度“Medium confidence0.4,其余参数保持默认设置。并运用Cytoscape 3.7.1PPI网络进行拓扑属性分析,筛选PPI网络中的关键靶蛋白。

1.5  基因功能和通路富集分析

将黄芪治疗DN的潜在靶点导入Metascape平台,输入物种和分析物种均选择为“H. sapiens”,设置P0.01,对作用靶点进行GO注释分析及KEGG通路分析,筛选排名靠前的生物过程和通路,采用GraphPad Prism6.0软件对结果可视化。

2  结果

2.1  黄芪主要活性成分的筛选

利用TCMSP数据库共检索出黄芪化学成分87个。根据OB30%DL0.18的原则,再结合文献报道[6-7],补充一些虽然OBDL值较低,但含量较高,有药理活性的成分,如黄芪皂苷,最终筛选出候选化合物24个,主要包含黄酮类如槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)、芒柄花素(MOL0003930)及毛蕊异黄酮(MOL000417)等和皂苷类(黄芪皂苷IIV),见表1

2.2  黄芪作用靶点预测

通过TCMSP共检索出潜在靶点462个,删除重复项,共获得213个潜在靶点。基于Swiss TargetPrediction平台共获得345个基因靶点,删除重复项,得到155个潜在靶点。将2个平台预测基因合并,删除重复项,共得到332个潜在靶点。通过与Genecard数据库和CTD数据库中DN相关基因比对,得到172个化合物靶点与疾病靶点的交集,预测为黄芪治疗DN的靶基因。

2.3  网络图分析

2.3.1  成分靶点网络  如图1所示,以172个靶基因作为黄芪治疗DN的靶点,建立黄芪治疗DN的成分靶点网络图,共有196个节点、387条边。节点代表了活性成分及潜在的靶点,边代表了活性成分与靶点的相互作用,黄芪共有24个活性成分作用于相同或不同的靶点,网络图充分体现了黄芪多成分、多靶点治疗DN的机制。

经计算,该网络连接度平均为3.95,介度平均为0.02,紧密度平均为0.35。槲皮素、山柰酚、黄芪皂苷等14种成分连接度、介度、紧密度值均大于等于其平均值,提示这些成分可能是黄芪治疗DN的主要活性成分。主要活性成分的拓扑参数见表2

2.3.2  靶蛋白PPI网络分析  如图2所示,PPI网络共有172个节点,3 369条相互作用连线。经计算,整个网络节点“连接度”中位数为32,因此,选择“degree64”的节点作为候选靶点(大于等于2倍中位数值),共筛选到36个候选靶点;接着对候选靶点的相互作用信息进行提取分析,并以连接度、介度、紧密度值大于其相应中位数为筛选条件进一步筛选节点,最终得到黄芪治疗DN的关键靶点  18个。

18个关键靶点导入Metascape数据库,获得靶点对应的蛋白功能,结果见表3。表明黄芪治疗DN过程,有转录因子、酶和信号通路等相关蛋白物质的参与。

2.4  GO注释分析和KEGG富集分析

使用Metascape数据库对黄芪治疗DN172个潜在靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析,并通过GraphPad Prism 6.0将分析结果可视化。结果见图3

GO注释分析由分子功能(molecular functionMF)、生物过程(biologicalprocessBP)、细胞组成(celluar componentCC3个部分组成。由图3可知,BP(图3-A)中排名靠前的有对氮氧化物、氧化应激的调节,细胞运动正调节,细胞因子介导的信号通路、MAPK信号通路;MF分析(图3-B)主要是蛋白域特异性结合活性、蛋白激酶活性、丝氨酸水解酶活性、转录因子结合活性靠前,主要涉及调节蛋白激酶、转录因子活性;在CC分析(图3-C)中靠前的是膜筏、突触、细胞外基质、受体复合物等,主要集中在细胞膜和蛋白复合物上。

KEGG通路分析(图3-D)显示,黄芪治疗DN靶点涉及靠前的通路主要有肿瘤信号通路、AGEs-RAGE介导信号通路、内分泌抵抗信号通路、转录激活因子(Jak-STAT)信号通路、胰岛素抵抗(IR)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、叉头框转录因子OFoxO)信号通路、核转录因子-κBNF-κB)信号通路等。

3  讨论

3.1  DN发生发展的分子机制研究

晚期糖基化终末产物(advancedglycation end productsAGEs)及其受体(receptorof advanced glycation end productsRAGE)系统能增强氧化应激、激活NF-κB途径,刺激产生一些细胞因子和生长因子,在糖尿病并发症的发生、发展中起重要作用。刘智辉等[8]研究发现,AGEsRAGE作用后可引起活性氧(ROS)产生增加,氧化应激可加重肾脏系膜细胞的损伤,引起足细胞凋亡。AGEsRAGE结合后,激活了磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K/蛋白激酶BAkt)信号通路。PI3K/Akt信号通路是胰岛素调控血糖的关键通路之一,与IR关系密 [9]。张翠香等[10]研究发现,与对照组相比,DN模型组大鼠肾组织中PI3KAkt活性升高。目前DN也被认为是一种由糖脂代谢紊乱引发的炎性反应性疾病,炎症反应在DN的发生发展中发挥重要作用。活化的Jak-STAT信号通路通过诱导炎症细胞活化、促进炎症介质表达、增加促炎因子产生等途径,导致糖尿病肾组织炎性损伤,最终引起DN[11]NF-κB是一种多靶向的细胞因子,其激活可导致多种炎症介质如IL-1β、肿瘤坏死因子TNF-α)、IL-6等释放,引起肾脏炎症反应,加速肾间质纤维化进程。

3.2  黄芪治疗DN的主要活性成分与关键靶点探讨

本研究得到的黄芪治疗DN的成分靶点网络图显示槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花素、黄芪皂苷等14种化合物的连接度与介度较高,可作用于多个DN靶点,提示这些成分可能是黄芪治疗DN的重要成分,值得进一步研究。槲皮素的潜在靶点最多,有106个,其次是山柰酚有47个潜在靶点。朱开梅等[12]研究发现,槲皮素可通过干预转化生长因子-β1TGF-β1/Smad7通路,抑制足细胞分泌VEGF,对DN起保护作用。常陆林等[13]研究发现,槲皮素能通过改善氧化应激和抗炎作用,减少炎症因子人单核细胞趋化蛋白-1MCP-1)、IL-6TNF的表达,改善早期糖尿病肾功能。汤利华等[14]研究发现,山柰酚可抑制DN大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体3NLRP3)炎症小体的激活,抑制IL-1βIL-18IL-6TNF-α等炎症因子的表达,对DN大鼠肾功能起保护作用。研究显示[15],山柰酚可抑制大鼠及人肾小管细胞中RhoA/Rho激酶活化介导的炎症反应,减少TNF-αIL-1β等促炎因子的表达,可作为治疗DN的潜在药物。异鼠李素能抑制糖尿病大鼠肾组织NF-κB系统过度活化,降低炎症因子TNF-αIL-6TGF-β1的蛋白和mRNA水平,延缓DN进展[16]

肖峰等[17]研究发现,黄芪皂苷提取物对糖尿病大鼠具有一定的肾脏保护作用。黄芪总苷通过上调基质金属蛋白酶2MMP2)、MMP9IL-10的分泌发挥抗纤维化作用[18]。黄芪甲苷在黄芪中含量最高[6],研究发现[19]黄芪甲苷能够抑制肾脏中NF-κB介导的炎症基因表达,降低糖尿病患者血清中TNF-αMCP-1的含量,减少足细胞的损伤。王琳琳等[20]研究发现,黄芪甲苷能下调Akt/NF-κB信号通路p-Akt蛋白表达,对高糖环境下人肾小球系膜细胞的氧化应激损伤起保护作用。黄芪甲苷通过影响细胞周期蛋白Cyclin D1CCND1)的表达,对肾小球系膜细胞氧化应激损伤起保护作用[21]

PPI网络分析结果发现,EGFRVEGFAJUNMAPK8IL-10IL-6TNF18个靶标是PPI网络的关键靶蛋白。EGFR的激活上调了ROS产生和内质网应激,在DN发病机制中起重要作用。VEGFDN患者的氧化应激状况相关,IL-10IL-6TNF是促炎因子,MAPK8基因与脂肪代谢有关,炎症反应和脂质代谢紊乱是DN发生的重要危险因素[22]18个关键靶标主要与氧化应激、炎症反应相关,黄芪的主要成分槲皮素、山柰酚、黄芪甲苷等通过调节EGFRJUNMAPK等靶蛋白,减轻氧化应激,抑制IL-10IL-6TNF等炎症介质的表达,起到延缓DN进展的作用。

3.3  黄芪治疗DN的信号通路探讨

KEGG分析结果显示,黄芪治疗DN靶点涉及通路主要与氧化应激、炎症反应和脂质代谢紊乱有关。王兴红等[23]研究发现,槲皮素可通过调控肾脏p38-MAPK/NF-κB信号通路,减轻氧化应激,抑制炎症反应,对DN大鼠肾脏起保护作用。陈妮等[24]研究发现山柰酚通过调节p38MAPK通路,对高糖培养的大鼠肾系膜细胞起到保护作用。田心等[25]研究发现刺芒柄花素对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞NF-κB信号通路及系膜细胞增殖具有抑制作用。有研究表明[26]黄芪甲苷能在体外抑制p38-MAPK通路,减轻氧化应激,改善足突融合及足细胞凋亡,维持足细胞数目的稳定,减少尿蛋白排泄,延缓DN进展。马可可等[27]研究发现,黄芪甲苷可通过抑制PI3K/Akt/FoxO1信号增加肾组织细胞自噬活性,减缓DN的发展进程。因此,可推测黄芪的主要成分槲皮素、山柰酚、黄芪甲苷等通过调节氧化应激、炎症反应、足细胞凋亡等途径,起到延缓DN进展的作用。

VEGF尤其是其亚型(VEGF-A)可影响肾小球滤过功能,启动并加重DN的进展。足细胞产生VEGF对维持肾小球结构和功能具有重要意义,Veron[28]观察到足细胞过表达VEGF的小鼠发生蛋白尿、肾小球损伤、系膜增生、基膜增厚等一系列DN的病理改变。而DN患者的肾活检组织中却发现VEGF的表达降低,且VEGF的表达与蛋白尿呈负相关。表明在疾病状态下,VEGF过多或过少表达均能引起肾脏损伤。令笔者感兴趣的是黄芪是一种双向调节剂,推测黄芪可通过维持足细胞VEGF的表达平衡,发挥减轻肾脏损伤作用。关于黄芪通过抑制VEGF表达对DN大鼠肾功能发挥保护作用的研究已有文献报道[29]。但黄芪通过减少足细胞丢失,增加VEGF表达而延缓DN发生发展的研究尚未见报道,本课题组后期将进行相关研究。

3.4  黄芪治疗其他疾病的物质基础及分子机制研究

KEGG分析显示涉及疾病通路最多的是肿瘤疾病相关信号通路,表明黄芪在治疗肿瘤疾病中有一定的功效。近年来,关于黄芪抗肿瘤的作用日渐被重视,其临床应用也扩展到对肿瘤患者的治疗当中。目前黄芪的抗肿瘤作用成分主要集中在黄芪皂苷和黄芪多糖。黄芪多糖可增强机体免疫力,抑制癌细胞的增殖,与抗癌药物联合使用具有协同作用[30]。黄芪皂苷可通过影响VEGF/MMP信号通路介导的抗血管生成和PI3K/Akt/mTOR通路介导的癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用[31]

综上所述,黄芪可能通过参与物质代谢、信号转导、炎症反应等过程改善DN肾损伤状况;调控AGEs-RAGEPI3K/Akt/FoxONF-κBJak-STAT等信号通路发挥延缓DN发生发展作用。本研究通过网络药理学的技术与方法,阐明了黄芪活性成分、靶点、通路之间相互作用的关系,发现黄芪及其活性成分能通过多靶点、多通路发挥抗DN的作用,为后期的验证性研究提供了理论依据。

参考文献(略) 

来  源:宋建波,廖  晖,李元平.基于网络药理学探讨黄芪治疗糖尿病肾病作用机制 [J]. 中草药, 2020, 51(11):2988-2996.

 

文献解读

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