老司机带你一文掌握lncRNA研究的套路

LncRNA大家都不陌生,是各领域研究的热点。2019年4月29日,曹雪涛院士团队在 Nature Immunology 杂志上发表名为“The long noncoding RNA Lnczc3h7a promotes a TRIM25-mediated RIG-I antiviral innate immune response”的文章。

这篇文章作者首先发现了一种新的LncRNA,Lnczc3h7a,它可以先与TRIM25结合,随后与活化的RIG-I结合,作为一种分子支架来稳定TRIM25-RIG-I相互作用,促进RIG-I和下游信号传导的K63连接泛素化。那么小编带各位读者利用这篇Nature Immunolog,带大家解析LncRNA的文章套路。

1.寻找功能lncRNA

作者首先通过RIP技术和全转录本测序技术对VSV病毒感染的细胞进行实验,找出了可以与TPIM25结合的RNA。通过对TOP20的lncRNA进行siRNA,最后筛选出一条lncRNA,利用其在基因组上的位置命名为Lnczc3h7a。

2.lncRNA定位及全长

接下来作者利用5’和3’RACE确定了该lncRNA全长序列为603nt并不能编码蛋白质。随后的RNA荧光原位杂交(FISH)分析显示无论是否存在病毒感染,lnczc3h7a与TPIM25共定位于细胞质中。

之后作者由利用siRNA以及构建lnczc3h7a敲除细胞系后发现会抑制RNA病毒诱导的免疫应答以及减弱RIG-I信号通路。并且构建了敲除小鼠,观察到明显表型后进行进一步机制探索。

3.lncRNA与蛋白质相互作用研究

随后利用CO-IP实验,发现Lnczc3h7a过表达对于TRIM 25的二聚化和K63泛素化均不受影响。之后RNA pull-down实验表明lnczc3h7a与TRIM 25 SPRY结构域的结合可以促进RIG-I的k63连接泛素化。

为了进一步研究Lnczc3h7a如何促进TRIM 25和RIG-I之间的相互作用,作者进行了RNA pull-down试验和RIP实验。最后表明Lnczc3h7a与活化的Rig-I的螺旋酶结构域结合。通过RNA pull-down表明Lnczc3h7a只选择性的与有活性的Rig-I的聚合物结合。

4.lncRNA与蛋白质结合位点

iCLIPs实验结果显示TRIM 25与核苷酸311附近的Lnczc3h7a结合,Rig-I与lnczc3h7a结合在核苷酸308和332附近,进一步解析出lncRNA与蛋白质相结合的核苷酸位点。

怎么样,看完这篇研究之后是不是觉得茅塞顿开呢,对于lncRNA这种研究热点,不妨跟随大牛的脚步,研究方法细致一些,5分的SCI也是手到擒来啊。

市面上有许多公司都可以做LncRNA的相关实验,RNA pull down 市场价在 12000 – 22000左右。CO-IP在2800左右,RIP在5000左右,RACE在2000-7000左右,RNA FISH在500-1000左右,iCLIPs的价格从抗体到实验价格不等。这类研究需经费支持,所以有资金、有样本的小伙伴们赶快行动起来啊。

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