David Liu开发以CRISPR-Cas13为基础的RNA m⁶A精准编辑新工具

DNA和蛋白修饰的动态变化在基因表达调控中的重要性已广为人知。近年来,RNA转录后修饰在基因表达调控中的作用也正为研究者所关注,这其中m6A甲基化修饰是最多的RNA修饰类型,其功能研究也取得众多成果:m6A 修饰在染色体开放性、RNA剪接、RNA出核转运、RNA稳定性及翻译效率中均有重要的调控作用;此外,其在多种细胞生理及病理过程中如干细胞增殖和分化、细胞热激应答、生物钟、肿瘤发生、记忆形成及抗肿瘤免疫中亦扮演重要角色【1】。虽然m6A研究如火如荼,目前依然缺乏有效的方法实现活细胞中m6A RNA甲基化的精准编辑,这也限制了更进一步的功能和机制研究。

m6A RNA甲基化修饰的发生主要依赖于甲基转移酶METTL3和METTL14形成的异源二聚体。2019年,有研究者将CRISPR-Cas9系统与METTL3及METTL14融合获得实现m6A RNA精准编辑的新工具,该工具包含dCas9- METTL3-METTL14融合蛋白、sgRNA和寡核苷酸链三种组分,主要在胞浆中介导m6A的精准编辑【2】。考虑到m6A修饰对细胞核内RNA的重要调控作用,开发新的m6A精准编辑工具非常必要。

2020年6月29日,来自美国哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所的David R. Liu实验室在Nature Biotechnology发表题为Programmable m6A modification of cellular RNAs with a Cas13-directed methyltransferase的论文。文章以RNA靶向的内切酶系统CRISPR-Cas13为基础,构建出新的m6A RNA精准编辑工具–TRM编辑器(图1)该工具只需融合蛋白和向导RNA两种组分,可实现细胞核和胞浆内m6A的高效精准编辑。之后研究者还利用该工具证实了m6A甲基化改变对RNA转录本丰度及可变剪接的重要调控作用。

图1 RNA m6A甲基化机制及TRM编辑器设计原理

为构建高特异性的RNA m6A精准编辑工具,研究者需要在保障靶位点m6A高效编辑的同时,有效降低脱靶位点处m6A甲基化的发生。体外实验证实,介导m6A修饰的METTL3-METTL14异源二聚体中,METTL3主要负责催化m6A修饰的发生,而METTL14在RNA募集中发挥重要作用。这表明METTL3单体或是实现RNA m6A精准编辑的关键。

之后研究者对METTL3的非必要结构域进行删减,获得仍具催化活性的截短蛋白M3,而后将M3与METTL14的特定结构域(METTL3互作结构域)融合,获得催化活性更高的融合蛋白M3M14。研究者进一步将M3及M3M14与失活型PspCas13b蛋白(dCas13)的C末端融合获得dCas13-M3和dCas13-M3M14融合蛋白(TRM编辑器),并对其介导m6A精准编辑的能力进行评估。

研究者首先在大肠杆菌中证实,在向导RNA的引导下,TRM编辑器dCas13-M3和dCas13-M3M14均可实现m6A的高效精准编辑;研究还发现,两种TRM编辑器的脱靶风险较低,且脱靶风险与融合蛋白中甲基转移酶的活性相关。而后HEK293T细胞中的实验发现,dCas13-M3和dCas13-M3M14可实现外源RNA转录本的m6A精准编辑,且dCas13-M3具有更低的脱靶风险。

有鉴于m6A修饰对细胞核和胞浆RNA均有重要的调控作用,研究者在dCas13-M3和dCas13-M3M14的基础上分别添加入核信号(NLS)和出核信号(NES)获得dCas13-M3nls、dCas13-M3nes、dCas13-M3M14nls和dCas13-M3M14nes四种TRM编辑器,并在HEK293T细胞中对四种TRM编辑器介导内源性mRNA m6A修饰的能力进行检测。结果显示,dCas13-M3nls和dCas13-M3M14nes介导RNA m6A精准编辑的效率最高。

研究者还对dCas13-M3nls和dCas13-M3M14nes两种TRM编辑器介导RNA m6A精准编辑的特异性进行分析。结果显示,TRM编辑器对向导RNA靶位点3’端下游10bp处的腺嘌呤(A)具有最高的m6A编辑效率,此外,TRM编辑器具有与METTL3-METTL14复合物类似的序列偏好性,主要介导DRACH中腺嘌呤的m6A编辑。之后,研究者还在转录组水平对两种TRM编辑器的脱靶效应进行评估,发现dCas13-M3nls对转录组整体的m6A修饰水平并无明显影响,在>21,000处潜在的m6A修饰位点处,约600-750处的m6A修饰有明显改变;与此相对的是,dCas13-M3M14nes会导致转录组整体的m6A修饰上调约1.3倍,且会导致4,000-5,500处位点m6A修饰的明显增加。不过dCas13-M3nls和dCas13-M3M14nes两种TRM编辑器对基因表达并无明显影响。研究还指出,与dCas9- METTL3-METTL14融合蛋白相比,dCas13-M3nls和dCas13-M3M14nes两种TRM编辑器具有更高的特异性,其中dCas13-M3nls的脱靶风险更是降低了5.5倍。 

最后,研究者还利用新工具在HEK293T细胞中分析m6A甲基化对RNA转录本丰度的调控作用,结果显示Actb mRNA A1216位点的m6A修饰会促进其转录本丰度的明显降低;利用核定位的TRM编辑器dCas13-M3nls,研究者还发现,部分mRNA转录本中特定位点的m6A修饰会明显改变RNA剪接过程。

总体而言,该研究成功的构建出以Cas13为基础的RNA m6A精准编辑的新工具-TRE编辑器。与之前的m6A编辑工具相比,TRM编辑器更加简单,且可实现细胞核和胞浆内RNA m6A的高效精准编辑。新的m6A编辑工具的开发为m6A功能研究提供了更加有力的武器,这或将进一步推动m6A RNA甲基化研究的发展。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41587-020-0572-6

1.Zaccara, S., Ries, R.J. & Jaffrey, S.R. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nat Rev Mol Cell Biol 20, 608-624 (2019).

2.Liu, X.M., Zhou, J., Mao, Y., Ji, Q. & Qian, S.B. Programmable RNA N(6)-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates. Nat Chem Biol 15, 865-871 (2019).

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