文献解读:如何研究分泌蛋白

2020年4月25日,来自德国海德堡大学医院的Shirin Doroudgard团队在Journal of Molecular and Cellular Cardiology杂志上发表了题为Proteomic analysis of the cardiac myocyte secretome reveals extracellular protective functions for the ER stress response的研究性论文,首次发现内质网钙剥夺介导的内质网应激过程分泌的蛋白可增强心肌细胞活力,并揭示分泌蛋白GRP78通过CRIPTO/AKT/SMAD2信号通路发挥保护作用。

   
1. 引言
分泌蛋白是心脏外细胞功能的重要调节因子。例如,心肌细胞分泌的蛋白质可以通过旁分泌和自分泌机制发挥作用,增强心肌细胞和心脏其他细胞类型的活性。内质网(ER)依赖或经典的蛋白质分泌途径是心脏细胞分泌蛋白质的主要途径(图1A)。
影响心肌细胞内质网环境的条件会降低蛋白质折叠效率。错误折叠蛋白大量积累对细胞有毒性的,可以导致内质网应激,从而影响蛋白质分泌。内质网应激的急性反应包括蛋白质合成的整体减少(包括内质网中的蛋白质合成),这减轻了对内质网蛋白质折叠机制的需求,并可能减少分泌蛋白的运输(图1B)。
内质网应激导致多种信号通路的激活,即内质网应激反应,通过基因重编程细胞加强内质网蛋白折叠,减少因错误折叠蛋白积累造成的压力(图1C)。然而,如果急性代偿性内质网应激反应不足以恢复内质网蛋白折叠,长期内质网应激会影响细胞编程,导致细胞死亡,这被认为是失代偿性的。

图1
 
最近的研究表明内质网应激参与心脏病的发生发展,包括心脏肥厚、缺血性心脏病和心力衰竭。然而,心脏内质网应激对心肌细胞活性蛋白质分泌的影响尚不清楚。因此,本研究旨在探讨内质网应激对心肌细胞蛋白质分泌的影响,以及内质网应激过程中蛋白质分泌的变化是否会影响心肌细胞活力。
2. 材料和方法
NRVM分离培养:酶消化法从14天大的新生大鼠心脏中分离出新生大鼠心室肌细胞(NRVM),按如下密度接种:

  • 缺氧模拟:将NRVM或AMVM培养基改为不含葡萄糖的DMEM ,2%FBS,置于低于0.1% O2的缺氧培养箱中。
  • 碘化丙啶/hoechest 细胞染色:碘化丙啶不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色,常用于细胞凋亡的染色。
  • Calcein Blue, AM染色:是一种细胞内酯酶底物,可作为活性探针,测量酶活性和细胞膜完整性。
  • 内质网应激诱导药物:thapsigargin(TG)是ER钙清空剂,导致NRVMs死亡;tunicamycin (TM)是一种蛋白糖基化抑制剂,可诱导NRVMs死亡;Brefeldin A(BFA)可以抑制蛋白质从内质网到高尔基复合体的运输。
3. 研究结果
1) 低容量培养基对心肌细胞活力的影响
如果NRVMs能分泌增强生存能力的蛋白,那么在低培养基容量下,分泌蛋白会比高培养基容量下更集中,因此若保持低培养基容量,心肌细胞活力将会提高。所以研究者将心肌细胞培养在低或高容量的培养基中,发现低容量培养基中蛋白质的浓度比高容量培养基中要高,并且培养基中蛋白质的含量也要高。此外,低容量培养基中心肌细胞活力比高容量培养更高,且在细胞高种植密度时更明显。这些结果表明NRVM分泌的蛋白通过自分泌/旁分泌机制提高心肌细胞活力。·

2) 内质网应激对心肌细胞活力的影响
接下来,研究者探讨了内质网应激在高或低培养基容量下对NRVM活性的影响,使用tunicamycin (TM)和thapsigargin (TG)诱导内质网应激。正如预期,无论培养基的容量大小,TM都以同样的程度降低了存活率。
相比之下,TG处理的高容量培养基中的心肌细胞存活率更低,而低容量培养基中的心肌细胞存活率未受影响。这些发现表明TG,而不是TM,通过ER依赖的经典分泌途径增加蛋白质的分泌,这些蛋白质可以保护内质网应激诱导的心肌细胞死亡。

3) 蛋白质组学分析—TG增加了一组特定的ER蛋白的分泌
由于保护因子是内质网蛋白分泌途径响应TG刺激而分泌的,因此研究者进行了蛋白质组学分析,以确定NRVM对TG反应分泌的蛋白。进一步分析蛋白质组学结果显示,TM处理后这些蛋白的分泌大部分减少(33个减少,4个增加,2个不变),TG(30个减少,5个增加,4个不变)。
值得注意的是,与对照组相比, GRP78、GRP94、calreticulin三种内质网驻留蛋白质,只有在TG处理的细胞中含量有所增加。研究者在细胞上用Westen blot进一步验证,发现TG和TM都提高了内质网应激蛋白GRP94, GRP78、CRT的细胞表达水平,但只有TG提高了培养基中这些蛋白的表达水平。

 

4) 模拟心肌缺血
已知TG可使心肌细胞中收缩的钙失调并激活内质网应激,为了检验病理生理学相关治疗的作用,研究者模拟了心肌缺血(sI)。免疫荧光、qRT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与之前的研究结果一致,缺氧激活内质网应激,高缺氧比低缺氧导致更多的细胞死亡,BFA处理增加了低缺氧下心肌细胞死亡。这提示低容量培养基可以保护模拟缺血诱导的心肌细胞死亡。

5) TG介导的内质网应激不依赖培养基容量
TG处理的高容量培养基是否会引起更多的适应性内质网应激呢?研究者以XBP1剪接作为内质网蛋白错误折叠的高灵敏度测量方法。TG处理后,高容量培养基与低容量培养基对XBP1 mRNA剪接的影响相似,在诱导大量适应性和非适应性内质网应激基因方面具有相似的作用。
因此,TG对心肌细胞活力的容量依赖性有利影响,并不是由于细胞内内质网应激信号对培养基容量依赖性的不同,而是由于细胞外因素,如培养基中的GRP78、CRT或GRP94水平的升高。

6) 机制研究:TG激活GRP78/CRIPTO信号通路
之前有研究表明,细胞表面GRP78在癌细胞中可以结合CRIPTO发挥作用,当细胞表面GRP78与CRIPTO结合时,AKT被激活,保护细胞凋亡,而抑制SMAD2活性,抑制相关凋亡。
所以研究者将重点放在了GRP78的机制研究上,发现TG处理的低容量培养基中GRP78的含量增加,AKT在丝氨酸473上的磷酸化水平升高,检测不到SMAD2的磷酸化,说明AKT被激活,SMAD2保持无活性。因此,这与TG处理的低容量培养基中分泌GRP78结合CRIPTO,保护心肌细胞凋亡的假设一致。

为了进一步检测心肌细胞分泌的GRP78对心肌细胞的保护作用,在TG处理的低容量培养基中使用siRNA敲低细胞内和细胞外分泌的GRP78,发现AKT和SMAD2促生存信号消失。为了探究NRVM存活对分泌GRP78的依赖程度,研究者在培养基中加入了GRP78的中和抗体,结果显示NRVM的存活也降低了。这些发现证明了GRP78以CRIPTO依赖的方式保护NRVM。

 
为了验证这一假说,研究者在TG处理的低容量培养基中用siRNA敲低CRIPTO,AKT激活被完全抑制,SMAD2磷酸化增强。这提示CRIPTO对TG处理的低容量培养基的NRVM的保护是必要的。此外,CRIPTO 敲低显著破坏了TG在低容量培养基下保护NRVM的能力。最后,CRIPTO特异性拮抗剂ALK4L75A模拟了CRIPTO 敲低的作用,在容量培养基下降低了TG对NRVM的保护能力。因此,证明了低容量培养中TG介导的保护作用需要CRIPTO/AKT/SMAD2信号通路。
4. 结论
TG或模拟缺血刺激了一组ER/SR驻留蛋白的分泌,这些蛋白在其他条件下不会分泌;在本研究中,鉴定了这些蛋白是GRP94、GRP78和CRT。当这三种蛋白被分泌时,它们以自分泌/旁分泌的方式保护内质网应激对细胞的不良影响。

 
5. 研究思路

研究者通过改变培养基的容量,同时结合蛋白质组学来研究心肌细胞的分泌蛋白,真是一种既简单又巧妙的方法,希望对你有所启发,我们下次文章解析再见吧!
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