人参皂苷Rb3通过调节AMPK/mTOR介导的自噬和抑制凋亡在体内外对顺铂所致肾毒性的保护作用

人参皂苷Rb3通过调节AMPK/mTOR介导的自噬和抑制凋亡在体内外对顺铂所致肾毒性的保护作用

 

吉林农业大学中药材学院Xing, J.J等人于2019年在“Cell proliferation”上发文“Ginsenoside Rb3 provides protective effects against cisplatininduced nephrotoxicity via regulation of AMPK/mTOR‐mediated autophagy and inhibition of apoptosis in vitro and in vivo”。(IF=5.753

前情提要

顺铂是临床上应用最广泛的化疗药物之一。

氧化应激和凋亡在顺铂诱导的AKI中起重要作用。在顺铂致肾损伤的病理生理过程中导致ROS的产生。在顺铂致肾损伤的动物模型中,ROS的过度积聚和GSH、SOD等抗氧化剂的减少参与了包括氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡在内的肾脏病理损伤。

顺铂通过内源性途径触发凋亡级联反应,导致线粒体功能衰竭。通过内在信号通路诱导细胞凋亡主要由Bcl-2家族蛋白调控,特别是促凋亡Bax抗凋亡Bcl-2蛋白Bax与Bcl-2形成异二聚体时,细胞色素c从线粒体释放和随后的细胞死亡被阻止。AKI中的凋亡是由Bcl-2和caspase家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的平衡caspase家族的激活调节的caspase3和caspase8是caspase依赖性凋亡的关键因子。顺铂在线粒体基质中积累时,引起大量活性氧的产生和线粒体功能障碍,导致线粒体通透性增加,促凋亡因子释放并启动凋亡。蛋白质Bcl-2家族在线粒体途径的凋亡机制中起着至关重要的作用,包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2 Bax,能够激活caspase9它负责参与一组蛋白质裂解的caspase3的蛋白水解激活相反,Bcl-2通过抑制Bax向线粒体的易位而发挥其抗凋亡活性。线粒体促凋亡蛋白BNIP3,属于Bcl-2家族,是由顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤激活的,被认为是AKI中对病理氧化的适应性反应。ROS至少可以通过激活AMPK部分参与信号通路。自噬和凋亡是高度相互联系的

顺铂会迅速诱导肾脏组织的自噬。ROS在哺乳动物细胞和组织中触发自噬。自噬在维持细胞内稳态方面起着重要作用,参与基本的生物学活动。自噬小体的形成包括自噬相关基因,以及通过光解裂解和脂肪作用将LC3-I转化为LC3-II被认为是哺乳动物的标志。自噬的激活刺激了ROS的形成,而顺铂暴露对ROS的积累有协同作用自噬的一个关键调节因子是mTOR,一种抑制自噬的营养敏感蛋白通过负调控自噬,MTOR起到中枢调节作用。AMPK抑制mTOR并启动自噬。因此,AMPK/mTOR信号通路可能参与调节自噬,以应对各种抗癌药物。一旦能量平衡被破坏,激活的AMPK可能会抑制mTOR活性,从而解除对自噬的抑制自噬和细胞凋亡在肾毒性的发展中起着关键作用 

人参皂苷Rb3(G-Rb3)是原人参二醇三萜皂苷的主要代表成分。人参皂苷作为人参的主要活性成分,具有抗糖尿病、抗肿瘤、抗氧化抗凋亡等多种治疗作用。本文首次报道了人参皂苷G-Rb3对顺铂肾毒性的保护作用。

目的

根据人参皂甙对顺铂所致肾损伤有较好的预防作用,本研究旨在评价人参皂苷Rb3(G-Rb3)对顺铂所致肾损伤的保护作用及其机制。

材料和方法

采用ICR小鼠模型和HEK293细胞模型,观察G-Rb3对顺铂诱导的急性肾功能衰竭的保护作用,并探讨其可能的作用机制。动物实验检测肾功能肾组织学炎症氧化应激凋亡相关蛋白分子自噬信号通路。采用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素AMPK特异性抑制剂C活性氧清除剂乙酰半胱氨酸(NAC)研究AMPK/mTOR信号通路对G-Rb3对HEK293细胞的保护作用。

结果

G-Rb3(10 mg/kg和20 mg/kg)预处理10d可明显逆转大鼠血清肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)和丙二醛(MDA)的升高,降低谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。组织病理学检查进一步证实G-Rb3可抑制顺铂诱导的肾毒性。G-Rb3降低顺铂诱导的p62、Atg3、ATG5和ATG7蛋白表达水平,降低p-mTOR蛋白表达水平和LC3-I/LC3-II比值,提示G-Rb3抑制顺铂诱导的自噬活化。抑制自噬导致细胞凋亡失活,提示自噬在顺铂诱导的肾损伤中起反作用。此外,我们发现G-Rb3可能潜在地调节AMPK相关信号通路的表达。

文章思路

研究从体内和体外不同水平,即动物实验和细胞实验进行验证,先证实了G-Rb3保护作用,然后从氧化应激、凋亡、自噬角度进行不同的阐述,最后对其机制进行探讨是否通过AMPK/mTOR通路起作用,再从氧化应激、凋亡和自噬角度探讨与AMPK/mTOR通路之间的关系。使用自噬抑制剂来确定自噬的作用,是否自噬在肾毒性中起负作用,如果是,它以何种方式参与。

顺铂诱导的细胞凋亡以前被认为与固有的线粒体和外在的死亡受体通路有关。为了阐明抑制ROS可以增加细胞凋亡水平的机制,我们使用了一系列与氧化应激调节相关的NAC。我们鉴定了经NAC处理的细胞具有潜在的抗凋亡功能,其在HEK293肾细胞中的表达下调超过1.5倍;再用ROS染色检查这些结果,表明细胞凋亡的调控可能与ROS的产生有关。为了阐明G-Rb3治疗导致细胞凋亡减少的分子机制,我们通过Western blot分析测定了Bcl‐2、Bcl‐XL、Bad和Bax的表达水平。结果表明,NAC可以显著逆转Bcl‐2和Bcl‐XL的减少,同时下调Bax和Bad的表达。如我们所料,G-Rb3 +顺铂和NAC细胞比NAC +顺铂细胞表现出更强的变化。

既往研究表明,顺铂可导致AMPK信号通路的激活,其结果可能易受AMPK失活的影响。因此,我们研究了自噬和凋亡的改变是否与AMPK信号通路有关。我们观察到化合物C加顺铂处理的细胞在AMPK时效率较低,而在自噬和凋亡时效率较高,表明AMPK的失活,细胞凋亡被抑制,可能是由于它们的低水平自噬

为了检测雷帕霉素对自噬的激活是否再次产生凋亡效应,我们将肾细胞在雷帕霉素不存在或存在的情况下暴露于顺铂中,并进行Western blot实验。雷帕霉素加重顺铂诱导的自噬和细胞死亡。G-Rb3加顺铂和雷帕霉素可减轻顺铂诱导的自噬和凋亡。

总结 

正如图所示,本研究阐明顺铂触发的自噬是通过激活AMPK/mTOR信号通路在小鼠和HEK293细胞中介导的。首次提出G-Rb3通过调节AMPK/ mTOR信号通路恢复抗氧化系统,通过抑制ROS介导的细胞凋亡和自噬抑制近端肾小管损伤,对顺铂致肾功能衰竭的保护作用及机制。具体来说,G-Rb3治疗逆转了水平 MDA、SOD和GSH。此外,G-Rb3抑制Bax、Bad、caspase3和caspase9的激活,增加Bcl-2,减少管状细胞的损伤、核碎裂和缩合。

References:

Xing, J.J., et al., Ginsenoside Rb3 provides protective effects against cisplatininduced nephrotoxicity via regulation of AMPK/mTORmediated autophagy and inhibition of apoptosis in vitro and in vivo. Cell proliferation, 2019. 52(4): p. e12627-n/a.

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