qPCR系列:数据分析第四关

      上一期介绍了生物学重复及技术学重复,本期讨论重复性的两个指标——repeatability和reproducibility。

 

Repeatability

       Repeatability衡量的是短期重复性表现或者单次分析实验内的变异程度,需要对同一个对象或者样本在完全相同的外部条件下进行多次测量。这个完全相同的条件包括测试者、实验程序和仪器等。qPCR中,同一块96孔板中设置的技术学重复就可以用于测量repeatability,一般用Cq值的SD来表示,也可以采用靶标浓度值的SD或者CV来表示。上一篇推送中我们已经讨论过技术学重复的数量对于repeatability的影响,在此不再赘述。

        Repeatability更多地用于比较不同的方法,同一个qPCR实验可以采用不同的扩增子位点、不同的探针和引物等,因而各自的repeatability就不同,择优选用。Repeatability可以mean Cq ± SD的形式表示,并测试3-4个靶标浓度(Fig. 1)。当然,常规实验无需大费周章的测试不同条件下的repeatability,而只要将样本的数据以mean Cq ± SD的形式表示即可。即便不加对比,也可以轻易判断repeatability的高低,如Fig. 1所示的38.00±0.05就是一个repeatability极好的数据。并没有严格的标准界定SD超过了多少这个数据就不合格,这取决于测试的误差水平对于表达差异分析的影响。

  

Figure 1. 不同探针组合的repeatability指标[1]

Reproducibility

       Reproducibility可翻译成“重现性”,通俗来讲就是别人做出来的实验你能有多大概率重复出来。MIQE也正是为了提高paper中qPCR实验的重现性而提出的。与repeatability正好相反,reproducibility需要测试不同条件下实验结果的重复性,如不同的操作者,不同的qPCR设备,不同的实验时间(day-to-dayreproducibility)等,以期得到的结论具有“普适性”。由于reproducibility涉及因素较多,因此不需要面面俱到,仅测试影响程度较高的因素即可,比如不同操作者带来的变异程度一般比同一型号设备的day-to-dayreproducibility更大。

       同repeatability一样,reproducibility也可用于比较不同方法的性能指标,这也是判断一个标准方法是否具备足够“兼容性”的有效方式。Reproducibility也可以用mean Cq ± SD的形式表示,但更推荐使用测定浓度的CV。Fig. 2展示了3个浓度下的reproducibility表现,美中不足的是采用了Cq的CV(%RSD)。之前讲过,这会低估reproducibility水平,从而造成偏差和误判。

Figure 2. 不同探针组合的reproducibility指标[1]

       Reproducibility还有个重要影响因素是板间差异inter-assayvariation,这就决定了要尽量采用样本数量最大化而不是基因数量最大化的布板方式。如果采用基因数量最大化的方式,或者样本的数量超过了96个,那么就需要板间校正inter-run calibrator。对于每一个靶标基因,在每块96孔板上都有三个技术学重复,最后根据mean Cq的差异来对其他的Cq数据进行校正(Fig. 3)。

Figure 3. 基因最大化布板策略需要用到Inter-RunCalibrator

       MIQE中对reproducibility的描述并不严格要求提供,但如果涉及多板数据(如DNA芯片分析),还是应该提供IRC的相关信息。

 

       接下来就是MIQE中最后一部分内容了,与统计分析相关。在这之前我会分享一些关于p值的观点和使用建议,作为引出统计分析的背景补充吧,敬请关注。  

参考文献

1.    Nagy, Alexander, et al. “Evaluationof TaqMan qPCR System Integrating Two Identically Labelled Hydrolysis Probes inSingle Assay.” Scientific Reports 7.1 (2017).

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