蛋白质组学+代谢组学揭示艾灸对强直性脊柱炎小鼠的作用机制

强直性脊柱炎(AS)是一种常见的脊柱关节病,是一种原因不明的全身炎症性疾病,全世界约有0.2%至1%的成年人受到影响。强直性脊柱炎的典型临床特征包括炎症性背痛、脊柱僵硬、畸形和强直、下肢滑膜炎、疲劳和关节外突等表现。其中年龄在20岁至30岁之间的男性年轻人中强直性脊柱炎的发病率最高,严重影响患者的生活质量。
目前,欧洲抗风湿联盟(EULAR)和美国风湿病学会(ACR)推荐了两种针对强直性脊柱炎的重要一线治疗方案,分别是非甾体抗炎药和系统的生物制剂疗法。非甾体抗炎药对部分强直性脊柱炎患者产生了良好效果,但是这些药物通常与心血管风险增加和胃肠道副作用有关。而新型生物制剂的成本过于昂贵,因此在持续的治疗过程中给患者带来了沉重的经济负担。
根据中医理论,强直性脊柱炎的病因是督脉湿冷、肾虚。艾灸可有效温通督脉、排除湿冷,增强人体恢复肾阳、促进气血循环的能力。因此本研究主要是采用代谢组与蛋白组联合技术,在系统水平上揭示艾灸治疗强直性脊柱炎的潜在分子机制。
部分结果展示:
1)组织学检查及炎性细胞因子的分析
 
通过病理组织学分析,发现与AS组相比,MA组和MNA组均能显著抑制AS小鼠关节间隙的变窄。然而,与MNA组相比,MA组对强直性脊柱炎小鼠的滑膜增生、炎症细胞浸润和软骨缺损有更为显著的改善。生理指标分析显示,穴位艾灸干预对改善强直性脊柱炎小鼠的关节炎特征有较好的效果。此外在炎性细胞因子的分析过程中,显示艾灸治疗组可显著降低炎症因子的水平。

图、不同处理间的病理组织学分析(A:HC组;B:AS组;C:MA组;D:MNA组)

 
2)代谢组学分析
 
通过对血清代谢组的分析,无论是在正负离子模式下,在HC、AS、MA和MNA组均有明显的差异。MA组的血清代谢谱的变化更接近HC组。穴位针灸处理后,由强直性脊柱炎模型引起的代谢紊乱有向正常状态转移的趋势。代谢组学共筛选出61种可区分的内源性代谢物,这些代谢物显示出HC组和AS组之间的显著变化。其中有21种差异代谢物,其中包括2种升高的代谢物和19种降低的代谢物。与AS组相比,有9种代谢物(磷酰胆碱、葡萄糖6-磷酸、L-苯丙氨酸、尿囊素、丝氨酸、乙酸、D-甘露糖、L-苹果酸和柠檬酸)在MA有显著改变,其中大多数与TCA循环和能量代谢有关。
图、代谢物的PLS-DA图及差异代谢物的火山图
 
3)差异代谢物的代谢通路分析
 
将21种差异代谢物进行代谢通路富集分析,结果发现这些差异代谢物主要参与乙醛酸和二羧酸代谢、氨酰-tRNA生物合成(氨基酸的活化)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、甘油磷脂代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、嘌呤代谢和丙酮酸代谢。
图、差异代谢物的代谢通路分析
4)蛋白质组学分析
 
基于DIA定量蛋白质组学分析共鉴定出7,614个肽,对应于来自HC、AS、MA和MNA组的混合血清样本中的486个蛋白质,486个蛋白质中的439个被成功地定量用于进一步的统计分析。在艾灸干预后,AS小鼠血清中34种蛋白质中的21种显著逆转,其中包括6种上调蛋白质和15种下调蛋白质。通过GO注释进一步阐述了艾灸干预的21种靶蛋白在小鼠血清中的复杂生物学功能,大多数丰富的生物学功能术语集中在脂蛋白代谢过程和炎症反应中。受艾灸干预后主要涉及苏氨酸肽酶活性、脂质和胆固醇代谢过程、黄嘌呤氧化酶活性和蛋白质结合。此外,为了深入了解与艾灸干预相关的途径改变,研究人员又进行了KEGG富集分析。结果表明,多个典型途径被改变,其中大多数与代谢途径(10%)、胆固醇代谢(8%)和蛋白酶体(6%)相关(图8A)。此外,通过酶联免疫吸附实验对差异蛋白进行了验证。

图、蛋白组分析结果展示
 
5)代谢组与蛋白组联合分析
 
蛋白质与代谢物的联合分析显示,矿物质吸收、脂质代谢、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和苯丙氨酸代谢途径在内的6种途径与艾灸的抗强直性脊柱炎作用密切相关。

图、蛋白组与代谢组联合分析网络图 
矿物质吸收:
在本研究中,强直性脊柱炎模型小鼠的血清TF水平比正常小鼠高,在艾灸干预4周后显著降低。因此艾灸可能对降低强直性脊柱炎急性期蛋白水平有直接作用。强直性脊柱炎的特征是肥胖和骨吸收增加。因此,艾灸可能通过降低血清TF水平来抑制小鼠骨的活性、钙化和矿化。Cp是一种金属蛋白,参与铜的排泄、铜依赖性氧化和铁转运。艾灸干预可以明显逆转这三种急性期蛋白的过度表达水平,表明艾灸在降低强直性脊柱炎急性期过程中起着关键作用。
脂质代谢途径: 
在这项研究中,脂质代谢途径的两个重要部分的胆固醇代谢和甘油磷脂代谢共享一个共同的脂蛋白,LCAT。与HC组相比,在AS模型组中,与胆固醇代谢相关的蛋白质(包括APOA、APOB、APOC1和LCAT)受到不同的调节。APOA是一种高密度脂蛋白(HDL)载脂蛋白,可以将胆固醇从组织转移到肝脏进行分解。重要的是,卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)是这一代谢过程中的关键酶,它可以提高APOA的表达,进一步促进胆固醇的清除。异位脂肪沉积可进一步促进炎性细胞因子的产生,导致强直性脊柱炎患者软骨功能障碍和退变。穴位艾灸可以通过上调与胆固醇合成和转运有关的APOA和高密度脂蛋白的表达水平来改善动脉粥样硬化的异位脂肪沉积。 
嘌呤代谢:
据报道,嘌呤代谢参与成人和儿童脊椎关节炎的发病机制,嘌呤代谢中蛋白质和代谢物的过量产生可加重强直性脊柱炎患者的关节和软骨组织损伤。XDH是嘌呤降解的关键限速酶,有助于将次黄嘌呤转化为黄嘌呤。肌苷和尿嘧啶是核苷酸通过嘌呤代谢途径的下游代谢产物。此外,肌苷还可以作为新的小分子粪便生物标志物,并显示出与炎症指标密切相关。甲氨蝶呤(MTX)是为强直性脊柱炎患者开出的二线抗风湿药物,通过抑制嘌呤代谢发挥抗炎作用。本研究结果表明,穴位艾灸疗法显著降低强直性脊柱炎小鼠XDH、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、黄嘌呤和尿嘧啶的分子水平,提示针刺和MTX具有相似的抗强直性脊柱炎作用机制。
延伸与讨论:
 
传统中药针灸在治疗众多疾病、疾病并发症等过程中均具有良好的效果。本研究基于代谢组学和蛋白组学技术,对中药针灸治疗强制性脊柱炎的潜在作用机制进行了系统的研究。研究发现艾灸可通过调节矿物质吸收、脂质代谢、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢途径来实现其抗强直性脊柱炎作用。那么本研究作为一种有前途的工具,可以从整体的角度促进未来的研究人员对艾灸治疗强直性脊柱炎潜在作用机制进行更为深入的理解。
 
参考文献:Multi-omics analysis at serum proteomic andmetabolomic levels reveals mechanisms of moxibustion for a mouse model ofankylosing spondylitis. 2020.
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