针对化疗耐药骨肉瘤中干细胞样祖细胞的联合治疗效果可由GSH响应型纳米颗粒增强

   

论文标题:Nanoparticle enhanced combination therapy for stem-like progenitors defined by single-cell transcriptomics in chemotherapy-resistant osteosarcoma

刊登日期:2020年9月25日

发表杂志:Signal Transduction and Targeted Therapy

影响因子:13.493

研究机构:中山大学中山医学院赵蔚课题组

技术手段:10X Genomics单细胞转录组测序、CHIP-seq(组蛋白)、RNA-seq、细胞异种移植

摘要
骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,通常对标准治疗有耐药性,因此迫切需要提高治疗方案的疗效,寻找新的治疗靶点。一小群具有干细胞自我更新特性的骨肉瘤细胞负责肿瘤的耐药和高转移潜力。因此,深入了解这些化疗耐药细胞的性质和分子机制非常重要。
本研究利用单细胞转录组测序技术构建了来自化疗耐受骨肉瘤患者样的得细胞类型特异性基因表达图谱。研究数据表明,VEGFR2和JMJD3 双阳性表达细胞为静态干细胞样细胞,据此建立了骨肉瘤中具有治疗抗性的干细胞样/祖细胞(高表达JMJD3基因)层次结构。协同VEGFR2抑制剂和JMJD3抑制剂可以抑制骨肉瘤细胞增殖和肿瘤生长。尽管针对骨肉瘤细胞的协同治疗可以通过激活促凋亡因子CHOP引起内质网应激,从而诱导凋亡,但干细胞样/祖细胞对此却表现出适应性应答,从而导致其存活。单细胞转录组测序数据同时揭示了骨肉瘤干细胞样/祖细胞通过增加GSH的合成以抵抗ER应激介导的凋亡作用来获得生存优势。更重要的是,通过使用谷胱甘肽响应型纳米颗粒(可以有效地装载和释放药物)可以显著改善协同治疗对干细胞样/祖细胞的治疗效果。
综上所述,本研究证实了GSH参与了骨肉瘤干细胞耐药进程,通过将GSH响应型纳米颗粒与靶向VEGFR2和JMJD3的小分子抑制剂封装在一起,极大促进了联合药物的药效,为解决干细胞样/祖细胞常规治疗耐受提供了解决框架,是一种有十分有前景的治疗方式。
文章结果
单细胞转录组测序在耐药骨肉瘤中鉴定干细胞样/祖细胞群体
图1
对1例化疗耐受骨肉瘤患者肿瘤样本做单细胞转录组测序,共获得7717个细胞,聚类得到9个细胞clusters,其中38.92%的细胞为浸润的免疫细胞(巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、NK细胞、粒细胞、CD8+ T细胞)(图1a、b);
剔除免疫细胞后对非免疫细胞重新聚类,获得了成纤维细胞样骨肉瘤细胞、软骨细胞样骨肉瘤细胞、内皮样骨肉瘤细胞和脂肪细胞样骨肉瘤细胞共4个clusters(图1c);
Feature Plot展示Marker基因表达(图1d),发现内皮样骨肉瘤细胞同时表达癌标志物MYC、表观遗传调控因子JMJD3、血管生成标志物VEGFR2和干细胞标志物CD117,表明内皮样骨肉瘤细胞是干细胞样细胞。
TSCAN和Monocle两种拟时序分析均构建出干细胞样/祖细胞(内皮样,表达CD117)-增殖细胞(软骨细胞样,表达COL8A1) 的发展轨迹,并发现MYC和JMJD3在干细胞样/祖细胞和增殖细胞(软骨细胞样骨肉瘤细胞)中富集,VEGFR2和CD117在干细胞样/祖细胞表达(图1e)。
免疫荧光发现JMJD3+/VEGFR2+细胞在更多的耐药患者样本中被鉴定,且细胞占比达到20%(图1f)。
抑制JMJD3和VEGFR2协同抑制骨肉瘤细胞的肿瘤表型
图2
为实现临床转化,优先选择JMJD3 和 VEGFR2作为靶点(二者均有小分子抑制剂),发现不同浓度(特别是在高浓度)的JMJD3抑制剂GSK-J4 (J4)和VEGFR2抑制剂阿帕替尼(Apa)组合对骨肉瘤细胞有协同抑制作用(图2a),且联合治疗对间充质干细胞没有毒性作用(图2b);
分别使用5μM J4和10μM Apa处理(最适组合浓度)两种高危和转移性骨肉瘤细胞株(SJSA-1和143B)进行,发现联合治疗效果高于单独用药治疗(图2c);
评估联合治疗对细胞周期的影响,发现联合治疗可以将细胞周期阻滞在S期,并显著降低G2/M的细胞数量;
Transwell(图2d)和划痕实验表明联合治疗可以明显抑制骨肉瘤细胞侵袭和迁移;
构建SJSA-1细胞异种移植模型,比较静脉联合注射J4(3mg/kg)和Apa(6mg/kg)治疗与单独注射药物治疗后肿瘤荧光图像差别,发现6轮治疗后联合用药治疗效果显著强于单独用药治疗(图2e、f)
抑制JMJD3和VEGFR2可增强内质网应激诱导的骨肉瘤细胞凋亡
图3
为了深入了解J4对骨肉瘤细胞的作用机制,对使用J4处理48h后的142B细胞做CHIP-seq(H3K27me3, H3K4me3, H3K27ac),发现J4处理组基因启动子区H3K27me3水平整体升高,一些特定基因的H3K4me3 和H3K27ac水平升高(图3a、b);
启动子和/或增强子上的H3K4me3和H3K27ac修饰对基因激活很重要,因此提取出H3K4me3 和H3K27ac水平均升高的基因并做GO分析,发现这些基因主要涉及到内质网应激引起的细胞凋亡,相关标志基因(CHOP、GADD34、ATF4、CEBPB)在J4处理下,无论是组蛋白修饰水平还是基因表达水平均明显提高(图3c、d、e);
为进一步探讨J4与Apa协同治疗骨肉瘤的作用机制,J4与Apa单独处理和联合处理的SJSA-1细胞系做做RNA-seq,发现联合治疗引起的差异基因数量最多(图3f)且大部分差异基因具有处理组特异性(74.3%)(图3g),且内质网压力基因在联合治疗组特异的差异基因中明显富集( GSEA分析)(图3h);
PCR和WB验证发现CHOP在联合治疗组表达显著升高(图3i、j),其他表达升高的基因还包括凋亡相关基因BAX、FAS、CASP3,而抗凋亡相关基因BCL2表达下调,同时细胞周期相关基因CDK4和CDKN1A的表达也明显变化.
骨肉瘤干细胞/祖细胞因较强的内质网应激耐受而在联合治疗中存活
图4
接下来作者评估了J4和Apa联合治疗对骨肉瘤细胞凋亡的影响,预期的那样,J4和Apa联合治疗后两个骨肉瘤细胞系凋亡水平显著增加,但是shRNA抑制CHOP后,阻滞了联合治疗后的引起的细胞凋亡(图4a);
但是评估J4和Apa联合治疗对干细胞样骨肉瘤细胞成球能力影响时发现,发现等剂量的联合药物不能显著降低干细胞样骨肉瘤细胞存活率或细胞的成球能力,也不会诱导干细胞样骨肉瘤细胞凋亡(图4b);
既往研究表明,GSH(谷胱甘肽)抗氧化途径可以驱动肿瘤产生内质网应激耐受,单细胞转录组测序数据分析发现GSH合成限速酶GCL的两个亚基(GCLC、GCLM)在耐药骨肉瘤的静息干细胞/祖细胞和增殖细胞亚群中高表达,GSH合成酶GSS在增殖细胞亚群中高表达(图4c);
GSH合成抑制剂丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)+J4+Apa共同处理细胞,与两个药物联合治疗相比,干细胞样细胞凋亡被明显诱导,但在非干细胞样细胞中,BSO+两个药物处理没有表现出比两个药物联合处理更明显的凋亡诱导效果(图4d);
BSO处理会显著诱导干细胞样细胞内CHOP高表达,但非干细胞样细胞CHOP表达不会被BSO诱导(图4e).
以上数据表明谷胱甘肽的抗氧化防御作用使干细胞样骨肉瘤细胞不受内质网应激诱导的凋亡的影响
GSH响应型纳米递药材料构建及特征分析
图5
为了解决这个问题,作者团队开发了基于半胱氨酸-PDSA聚合物的纳米颗粒(NPs),NPs载药能力和释药特性如下:透射电镜下NPs载药前后均呈球型(图5a)、动态光散射(DLS)发现NPs载药前后水力半径增加,表明药物被加载(图5b),NPs分散在粒子分散在去离子水时,载药纳米颗粒( NPJ4+Apa )zeta电位值在-20~-25 mV之间,而空白NPs呈电中性(图5c)、DLS测定载药颗粒在去离子水、PBS、10%含血清的DMEM中的稳定性,显示9d后水动力直径略有增加(图5d);
在高浓度GSH作用下,半胱氨酸-PDSA聚合物中的二硫键会分解,从而释放出药物分子。已知与正常细胞相比,大多数肿瘤细胞内GSH浓度为(2-10 mM),胞外GSH浓度为(2-10μM),研究发现GSH浓度为20mM时,递药颗粒可以释放94%的药物(图5e);
通过模拟肿瘤组织内的微环境条件、设定GSH浓度为5mM,评估载药颗粒对pH的反应,数据显示当pH从7.4调整到5.4时,观察到药物释放明显加快(图5f)。
纳米药物的细胞摄取和肿瘤靶向能力分析
图6
为研究GSH响应型NPs在介导细胞对药物摄取中的作用,以香豆素6(C6)为模拟药物进行NPs药物搭载,发现SJSA-1和143B细胞对装载C6的NPs (NPC6)的摄取明显高于游离C6,且在SJSA-1和143b衍生球体中NPC6穿透更深,分布更广泛(图6g);
为评估GSH响应型NPs的生物分布,在小鼠腹腔注射DiR和载DiR-NPs(NPDiR),24小时后对肿瘤小鼠主要器官进行全动物成像和主要器官体外成像,显示在给药后0 -24小时内,所有时间点内NPDiR在肿瘤部位的都比有力DiR更有效地积累(图6h)。
清除GSH使耐药骨肉瘤易于被联合用药治疗
图7
如预期一致,NPJ4+Apa对143B源性肿瘤球体具有清除gsh的作用,因此作者使用CellTiter-Glo检测系统检测发现NPJ4+Apa对骨肉瘤干细胞/祖细胞活性抑制能力显著,IC50(IC50=1.5μM)比游离用药低1.6.倍(图7a);
暴露在无药物培养基中的球状体在整个实验期间继续生长,并变得紧密。相比之下,用NPJ4+Apa孵育的细胞变得扭曲,许多细胞与球体分离,整个球体的生长被显著抑制。同时,NPJ4+Apa比含J4和Apa的非谷胱甘肽反应的NP以及游离用药具有更好的抑球性能(图7b);
骨肉瘤干细胞样/祖细胞最重要的特性是其自我更新和肿瘤再生的能力, NPJ4+Apa降低了球体中干细胞/祖细胞的比例(图7c);
将SJSA-1细胞衍生的球状体皮下移植到裸鼠体内, NPJ4+Apa处理比游离用药具有更明显的肿瘤生长抑制效果(图7d),且对小鼠无毒副作用(图7e);
TUNEL检测发现, 肿瘤组织中NPJ4+Apa比游离用药可诱导更多细胞凋亡(图7f)。
图8
一些研究表明,NPs可能在肝脏中有聚集的趋势,在本项研究中,体内成像显示肝脏对NPDiR的高摄取,而其他器官对NPs的摄取量低。为了评估NPs在肝脏积聚的后果,作者对携带SJSA-1肿瘤的小鼠的主要组织进行H&E染色,显示肝脏和其他主要器官一样未发生变化,NPJ4+Apa也没有增加丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)的水平,表示没有发生肝损伤(图8)
综上所述,研究团队研发的的GSH响应型纳米颗粒可以有效地将J4和Apa递送至骨肉瘤干细胞样/祖细胞中,这对于增加肿瘤细胞的药物吸收,优化药物细胞内释放时间以及提高耐药性骨肉瘤细胞的协同治疗效果具有重要意义。当然,也还需要对J4和Apa联合治疗方案开展进一步的临床试验,以系统地研究其对耐药骨肉瘤的影响,以及如何改善患者的预后。
参考文献
Wang L, Huang X, You X, Yi T, Lu B, Liu J, Lu G, Ma M, Zou C, Wu J, Zhao W. Nanoparticle enhanced combination therapy for stem-like progenitors defined by single-cell transcriptomics in chemotherapy-resistant osteosarcoma. Signal Transduct Target Ther. 2020 Sep 25;5(1):196. doi: 10.1038/s41392-020-00248-x. PMID: 32973147; PMCID: PMC7518281.
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