【热点追踪】同时涉及“RNA结合蛋白”和“m6A甲基化”两大科研热点

前一阵子国自然放榜,又是几家欢喜几家愁了。但是无论失败还是成功,都是非常宝贵的国自然申请经验,都将成为后续科研道路上的铺路石。

提高国自然标书中标率的一条捷径就是蹭热点,当然如何优雅有效地蹭上科研热点就很有技术含量了。今天小编要给大家分享的是一篇由国自然资助的急性髓系白血病(AML)相关研究文章,文章发表在《Blood》杂志上(影响因子为22.112),名为“YBX1 is required for maintaining myeloid leukemia cell survival by regulating BCL2 stability in an m6A-dependent manner”。文章同时涉及“RNA结合蛋白”和“m6A甲基化”两大科研热点。接下来我们来看下这篇文章是具体是如何优雅地蹭热点的:

研究背景

展开一项研究首先需要有一个很好的切入点,本文的切入点就是AML中异常表达的RNA结合蛋白(RBPs)。RBPs是细胞中一类重要的蛋白质,它们通过识别RNA结合域与RNA互作,在转录后水平参与调控RNA的剪接、稳定性、定位、翻译和降解等。已有研究表明RBPs的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。

研究结果

从文章提供的科学假说图我们可以了解到文章的研究结果,即髓系白血病细胞中RNA结合蛋白YBX1高表达的时候,其能通过与IGF2BPs互作共同提高m6A标记RNA,如MYCBCL2mRNA稳定性,进而促进细胞的存活,而YBX1低表达的时候,MYCBCL2 mRNA发生降解,细胞分化或凋亡。(今天我们来点不一样的,看研究内容之前先看研究结果,开动脑洞,如果直接给你这样一个研究结果,让你来设计实验来证明这样一个结果,你会如何设计?

研究思路

好了,我们来看下作者是如何从研究切入点扩展到成体系的研究结果的。首先肯定是确定目标RBP,然后是确定与RBP结合的RNA,并分析RBP调控RNA的具体方式,最后确定与疾病相关的RBP靶基因,这样就能将整个研究故事串联起来了。文章的研究思路可以概括如下:

研究内容

1.确定目标RBP YBX1

文章的切入点是AML中差异表达的RBP,因此作者利用TCGA分析了AML中1068个RBP的表达,发现YBX1在AML中高表达。显然AML中高表达的RBP有多个,甚至有不少RBP的表达比YBX1高,那么为什么选择最终YBX1,因为分析发现YBX1 mRNA和蛋白水平在AML患者和各类白血病细胞中均高表达小编猜想这里肯定有隐藏工作量,即作者把高表达的几个RBP都进行了检测,发现还是YBX1最理想)。

表达量的高低并不能直接说明YBX1AML疾病进展之间的联系,为此作者对YBX1进行敲减/过表达处理,然后从体外和体内两个角度来分析其与疾病的相关性:

体外分析:这里作者选用了两种类型的AML细胞,即人白血病干细胞LinCD34+和髓系白血病细胞MOLM-13/THP-1,分别进行YBX1敲减处理后,分析发现LinCD34+的克隆能力和体内重建能力显著降低,MOLM-13/THP-1的增殖和克隆原性受到显著抑制。随后,作者又在YBX1敲减细胞中恢复YBX1的表达进行挽救实验,分析发现上述细胞现象获得明显改善,表明YBX1AML细胞的存活密切相关

体内分析:这里作者构建了YBX1敲减和YBX1敲除两种小鼠模型,可谓研究逻辑缜密(当然也是不差钱)。比较有意思的是作者不光分析了模型小鼠的AML疾病进展情况,还对小鼠白血病细胞进行了增殖、迁移、细胞周期及凋亡等细胞表型分析,发现敲减/敲除YBX1,小鼠AML疾病进展明显延缓,白血病细胞增殖、迁移能力减弱,凋亡能力增强,外周血中白血病细胞的比例明显降低。

AML患者一般会出现骨髓造血功能障碍,这里作者分析了YBX1对正常造血功能的影响。通过比较野生型和YBX1敲除小鼠外周血中不同类型血细胞的数目和比例以及造血干细胞功能的变化,确定YBX1不影响AML小鼠的正常造血功能这里小编猜想直接研究YBX1与AML造血功能障碍之间的关系难度太大,故退而求其次研究其对正常造血功能的影响,当然这一部分研究内容是加分项而非必须项)。

2.分析与YBX1相结合的RNA

RBPs通常通过结合RNA在转录后水平参与调控RNA的功能。YBX1作为RBP,在AML中应该也是通过结合RNA来行使其调控功能的。为此,作者进行了RIP-seq分析,获得了大量与YBX1结合的RNA信息,对这些RNA进行了结合区域分析,发现YBX1结合位点与RNA m6A位点高度重合。随后,作者构建m6A标记的RNA来进行RNA pull-down实验,证实YBX1能够被m6A标记RNA拉下来,但进一步利用GST YBX1及RNA pull-down实验分析发现YBX1并不与m6A标记RNA直接结合

3.YBX1-IGF2BPs-m6A RNA分析

前面已经发现YBX1并不直接与m6A RNA直接结合,那势必存在其他桥梁物质来连接它们。为快速探究这个中间物质,作者查阅相关文献,发现YBX1能与IGF2BPs结合互作。IGF2BPs是m6A甲基化阅读蛋白,以m6A的方式稳定mRNA,这正好与之前发现的YBX1能够结合m6A RNA相对应。为此,作者进行了免疫共沉淀,确定YBX1能够与IGF2BPs蛋白结合。为确定IGF2BPs参与调控YBX1与m6A mRNA的结合,作者进行了一系列RNA pull-down实验,发现敲减IGF2BPs显著影响YBX1与m6A RNA的结合,而敲减YBX1不影响IGF2BPs与m6A RNA的结合,表明IGF2BPsYBX1m6A RNA的结合中是必不可少的

为进一步确定IGF2BPs、YBX1以及m6A RNA之间的互作关系,作者对IGF2BPs和YBX1的MeRIP-seq、RIP-seq数据进行整合分析,分析发现与两者结合的转录本高度重合,且均倾向于结合RNA的m6A区域。同时分析发现敲减YBX1,与IGF2BPs和YBX1结合的mRNA稳定性显著降低,表明YBX1可能通过IGF2BPs参与调控m6A mRNA的稳定性

为进一步确定YBX1以m6A的方式参与调控mRNA的稳定性,作者突变了YBX1的两个靶基因MYC和BCL2的m6A位点结合,结合荧光素酶报告实验以及YBX1和IGF2BPs敲减/过表达处理,确定YBX1参与调控IGF2BPs介导的m6A mRNA稳定性

4.YBX1相关m6A RNA分析

上述研究已经确定YBX1能够通过IGF2BPs参与调控m6A RNA的稳定性,但AML中m6A RNA有很多,具体哪些m6A RNA与AML疾病进展相关需要进一步研究。

作者首先从整体层面进行了分析,对野生型和YBX1敲减小鼠白血病细胞进行了RNA-seq分析,发现敲减YBX1后,凋亡基因表达显著升高。那么YBX1是否通过m6A方式凋亡基因表达,为此,作者利用m6A-seq和MeRIP-seq确定凋亡基因m6A水平显著升高。随后利用SLAM-seq分析发现敲减YBX1后,整体转录本的降解速率显著升高。为确定m6A修饰与mRNA降解相关,作者将m6A-seq与SLAM-seq数据进行整合分析,并比较m6A标记和未标记mRNA的降解速率,分析发现m6A标记mRNA的降解速率更高,且敲减YBX1能显著增强m6A标记mRNA的降解,表明YBX1m6A形式影响mRNA的稳定来参与调控凋亡基因的表达(这里所涉及的m6A水平以及RNA降解水平分析均是整体转录本水平的)。

前面已经证明YBX1协同IGF2BPs以m6A形式参与调控MYC和BCL2的稳定性,它们是否介导AML中YBX1的功能?为此,作者对YBX1敲减的人和小鼠白血病细胞分别过表达MYC或BCL2,分析发现其能显著挽救YBX1敲减导致的克隆原性和增殖缺失,抑制细胞凋亡的发生,表明BCL2MYCAMLYBX1的功能性下游靶点,其可作为YBX1AML疾病进展的直接连接者

点评

至此,整篇文章就结束了,我们不难发现作者的研究逻辑非常缜密,环环相扣,对于每一种可能出现的结果都做了相应的研究,同时对于每一部分结果都应用了大量的实验去验证。如果让你来设计这样一个项目,你是否同样能做到思路清晰明了,或者说你是否有更为合理的研究方法。当然啦,这篇文章的工作量和研究经费都是不容小觑的,光是各种组学的费用就能吓跑一拨人,但它仍不失为一篇很好地国自然研究思路范文,毕竟它蹭热点蹭得非常的自然,毫无矫揉造作之势,大家快学起来。

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