乙肝结合肝癌的生信分析新思路

生信文章以其“短平快”的特点,受到许多科研小伙伴们的青睐,各位童鞋们都绞尽脑汁拓展出一篇生信文章。今天就为各位医学童鞋安排解读2021年9月最新发表在Hepatology Communications(IF=5.073)期刊上的文章。本文别出心裁的将乙肝与肝癌相联系,挖掘出相关预测基因为进一步了解乙肝相关肝癌和开发潜在的治疗机会提供了重要的理论依据。大家赶快一起学起来,拓展出生信研究的新思路!

题目:The Matrisome Genes From Hepatitis B–Related Hepatocellular Carcinoma Unveiled  乙型肝炎相关肝癌母体基因的揭示

摘要

 

目的:慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染改变细胞外基质(ECM)的组成,使肝癌(HCC)的发生和发展成为可能细胞外基质蛋白及其相关因子的整合是肿瘤微环境的主要组成部分。本研究的目的是揭示乙肝相关肝癌的癌基因。

方法:从GEO和TCGA数据库中检索了444例乙肝相关肝癌的转录和临床特征。系统分析了与乙肝相关肝癌发生相关的母体基因、母体基因模块、肝癌亚组和肝特异性母体基因,并对其生物学功能和临床相关性进行了鉴定。

结果:系统分析了与乙肝相关肝癌发生相关的母体基因、母体基因模块、肝癌亚组和肝特异性母体基因,并对其生物学功能和临床相关性进行了鉴定。随后,我们发现了四个显著的母体基因模块,显示了与细胞周期活动相关的功能同质性。根据高度相关的母体基因,对两组乙肝相关性肝癌患者进行了分类。高表达组(TCGA组15.0%,GEO组17.9%)具有良好的临床预后、活化代谢活性、细胞周期衰竭、免疫浸润强、肿瘤纯度低等特点。4种肝特异性母体基因F9、HPX、IGFALS和PLG与乙肝相关肝癌的进展和预后密切相关。

结论:本研究通过对乙肝相关肝癌发生过程中肿瘤相关基因的表达和功能的研究,为进一步了解乙肝相关肝癌和开发潜在的治疗机会提供了重要的理论依据。

结果

1. 数据的获取和整理

 

从GEO中检索乙肝相关肝癌患者(GSE121248和GSE55092)处理后的微阵列数据,以鉴定与乙肝相关的癌变相关基因。从GEO检索乙肝相关肝纤维化患者(GSE 84044)和乙肝相关肝癌患者(GSE65485,GSE94660和GSE104310)的RNA-seq数据,以验证所发现的相关母体基因。将乙肝相关肝癌患者的转录谱与TCGA(n=60)和GEO(GSE 14520;n=218)的临床信息结合,进一步解释已鉴定的母体基因的生物学功能或临床相关性。本研究共抽取444例乙肝相关肝癌患者的152例非肿瘤标本和470例肿瘤标本进行研究。

 

2. 乙肝相关肝癌相关基因鉴别乙肝相关肝肿瘤与非肿瘤

 

在乙肝相关癌变过程中,GSE55092和GSE121248微阵列转录数据集中下调的母体基因的数量是上调基因的3倍(图1A)。在这两组数据中,共有80个调控异常的母体基因,其中63个基因显著减少,17个基因表达增加。这些常见的异常表达的母体基因在乙肝相关癌变过程中被命名为HHMGS。已鉴定的HHMGS的主要细胞来源为肝细胞(29 HHMG)、内皮细胞(39 HHMG)、HSCs(26 HHMG)、EpCAM+细胞和胆管细胞(19 HHMG)和Kupffer细胞(12 HHMG)。它们在KEGG的通路中显著丰富,并分为三类:免疫应答、细胞外基质重构和癌变(图1B)。重要的是,所鉴定的HHMGS可以作为一种联合标志来鉴别乙肝相关的肝肿瘤和非肿瘤标本。事实上,从合并的GSE55092和GSE121248数据集中提取的样本通过层次聚类分析(HCL)被聚类为肿瘤或非肿瘤(图1C)。进一步对80个HHMGS进行主成分分析(PCA),前两个主成分(PCS)信息最丰富,分别解释了总观测方差的51.8%和10.4%。如图1D所示,PCA图进一步证实了HCL分析的分类能力,因为在合并的两个微阵列转录数据集中,前两个PCs清晰地区分了肿瘤和非肿瘤样本。

       

3. HHMGS诊断能力强

 

鉴于肝肿瘤组织的异质性,要获得具有稳定诊断潜力的信号是很有挑战性的。为了测试已识别的HHMGS的诊断性能,从GEO数据库中检索了三个独立的乙肝相关肝癌的RNA-seq数据集。正如预期的那样,根据80个HHMGS的表达,HCL分析清楚地将肿瘤与非肿瘤样本在所有三个RNA-seq数据集中分离开来(图2A,左)。HHMGs在乙肝相关性肝纤维化中的总表达模式(图2A,右),进一步暗示已鉴定的HHMGs与乙肝相关性肝纤维化无关,而是与肝癌相关。为了消除聚类方法的偏差,进行了聚类分析,得到了与HCL分析结果基本相同的结果(图2B)。对各HHMG患者的诊断能力进行ROC曲线分析。如图2C所示,几乎所有HHMGS都具有很强的鉴别乙肝相关肝肿瘤和非肿瘤标本的诊断能力,因为大多数HHMGS的曲线下面积(AUC)值在所有五个与乙肝相关的肝癌数据集中都是>0.7。这些结论表明,HHMGS的诊断能力是有潜力的。

       

 

4. HHMGS在乙肝相关癌变过程中的作用

 

为了进一步了解HHMGS在慢性乙肝病毒感染中的作用,我们利用STRING数据库构建了基于已鉴定的HHMGS的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。如图3A所示,80个HHMGS中的64个与237个预测的相互作用高度关联。然后,使用 ClusterONE算法来挖掘这些模块,在这些模块中,母体基因表现出高度的功能同质性。在HHMG相关的PPI网络(图3A)中,共发现4个显著的母体基因模块。在合并的GSE55092和GSE121248数据集中,这些模块中的母体基因构成了一个组合特征,对乙肝相关肝癌具有近乎完美的诊断潜力,AUC值分别为98.9%、98.6%、100%和99.5%(图3B)。通过HCL 分析,这四个基因模块可以独立地将所有合并的样本分为两组:非肿瘤样本在第1组中占多数,而肿瘤样本在第2组中占多数。基因集富集分析(GSEA)分析显示,细胞周期在第2组中全部激活,由四个已鉴定的母体基因模块分离(图3C)。鉴于细胞周期进展在促进肝癌发生中起着核心作用,总的来说,这些母体基因的异常表达可能与乙肝相关癌变过程中的细胞周期失调有关。

       

 

5. HHMGS鉴定不同临床结局的乙肝相关性肝癌的不同亚组

 

基于TCGA队列中的表达谱,通过Pearson相关分析,探讨了80个HHMGS之间的共表达关系。在HCL聚类之后,确定了一个具有19个HHMGS高度相关的协商一致的集群。19个HHMGs的主要细胞来源为内皮细胞(14个HHMG)和HSCs(7个HHMG)。根据这19例HHMG的表达谱,TCGA组中与乙肝相关的肝癌患者按HCL聚类分为两个亚组(图4A)。随后,对218例乙肝相关肝癌(GSE14520)的另一组患者进行了独立分析,并确定了两个不同的肝癌分子亚组(图4B)。为了探讨这两个亚组是否代表临床不同的患者,比较了年龄、性别、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和甲胎蛋白(AFP)、多结节状态、肿瘤大小、肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分期和巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期。除高表达组在GEO组中的肿瘤体积小于低表达组(图4A,B)外,两亚组在这些参数上差异无显着性(图4A,B)。然而,Kaplan-Meier曲线显示,高表达亚组与TCGA和GEO队列中的低表达亚组相比,不仅显着延长总生存期,而且无复发生存期(图4C,D)。这表明19例HHMGS低表达的乙肝相关性肝癌患者的临床疗效不佳。

       

 

6. 乙肝相关性肝癌患者的亚组表现出离散的分子功能特征和肿瘤纯度

 

作者探讨了这两个亚组患者的分子功能特征。GSEA分析表明,TCGA和GEO的高表达亚组主要与免疫相关、代谢相关和细胞外基质相关通路的激活有关,而低表达亚组与DNA复制和细胞周期等癌变相关途径的激活有关(图5A,B)。由于肿瘤纯度已被报道与预后相关,使用估计算法来比较两个亚组间的肿瘤纯度。如图6A、B所示,TCGA和GEO的高表达亚组肿瘤纯度较低,StromalScore, ImmuneScore和 ESTIMATEScore明显高于低表达组。然后,使用MCPCounter算法来量化非肿瘤细胞群在子群之间的绝对丰度。在高表达亚组中,大多数非肿瘤细胞类型比低表达亚组更丰富。TCGA组细胞毒性淋巴细胞、B系和自然杀伤细胞显著(图6A),而T细胞、B细胞系、髓样树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞在GEO队列中显著(图6B)。

       

       

 

7. 肝特异性HHMGS与乙肝相关肝癌的关系

 

筛选GTEx,PLG、HABP2、HPX、IGFALS、F9、MBL2、INHBE、HGFAC、SERPINF2和PINA 7在正常肝组织中均有高表达。人类蛋白质图谱数据库的结果进一步证实了GTEx数据库的发现。单细胞数据分析显示,F9、HGFAC、INHBE、MBL 2和SERPINA7仅在肝细胞中表达,而HABP2、HPX、IGFALS、PLG和SERPINF2主要在肝细胞和胆管细胞中表达。通过使用GEO队列分析它们的临床相关性和生物学功能来评价它们作为治疗靶点的潜力。如图7A-C所示,在所有已鉴定的肝特异性HHMGS中,F9的高表达与血清AFP活性降低、TNM或BCLC分期有关。HPX高表达者AFP活性低,肿瘤体积小,TNM或BCLC分期低。高表达IGFALS是小肿瘤大小、TNM分期低、整体或无复发生存期延长的标志。此外,PLG的高表达可预测低血清ALT和AFP活性,减少结节,低TNM或BCLC分期,延长整体或无复发生存期。GSEA分析显示,F9、HPX、IGFALS和PLG的低表达与多种代谢途径的激活呈负相关,但与细胞周期的激活或DNA复制呈正相关,提示这些肝特异性HHMGS是可能成为乙肝相关肝癌抗肿瘤靶点的抑癌基因。

       

 

结论

 

本研究确定了10个严格表达于肝细胞或胆管细胞中的肝特异性肿瘤基因,其中F9、HPX、IGFALS和PLG对乙肝相关肝癌的进展和预后有重要的临床意义。

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