Cre-LoxP系统:基因编辑动物技术

搞好科研你不得不懂模式动物,搞好模式动物你不得不懂基因编辑,搞好基因编辑你不得不懂大名鼎鼎的Cre-LoxP系统。本文详细介绍Cre-LoxP系统的原理、基因编辑模式动物中的应用以及现有的不足。

1. Cre-LoxP系统定义

Cre(cyclization recombinase)即环化重组酶,来源于P1噬菌体的拓扑异构酶,343个氨基酸构成,分子量38kDa,包含四个亚基和2个结构域。主要识别DNA上特异性位点(LoxP),进而诱导DNA发生同源重组,从而促使特异性DNA片段缺失、颠倒或易位等。

LoxP (locus of X-over P1),及Cre识别的DNA位点,包含两段分别位于两端的反向互补序列(红色)和一段位于中间的间隔序列(蓝色):ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。反向互补序列是Cre识别位点,而间隔序列则决定了LoxP位点的方向,是发生同源重组的位置,其中间隔序列中的N代表不同碱基,决定了不同LoxP位点,但是一般只有相同LoxP位点才能发生DNA同源重组。

       

(Lab Anim Res. 2018 Dec; 34(4): 147–159.)

2. Cre-LoxP系统作用原理

Cre特异性识别LoxP位点两端反向互补序列,形成二聚体,而另一个相同LoxP位点上的形成同样二聚体,两个二聚体结合形成四聚体。四聚体上的Cre特异性切割两个LoxP位点的DNA片段,根据LoxP位点的方向性,发生不同的重组。主要有三种:(1)基因剪切(deletion):两个LoxP位点位于同一DNA链上,且方向相同,则Cre促使LoxP间的DNA序列切除;(2)基因倒位(inversion):两个LoxP位于同一DNA链上,但方向相反,则Cre促使LoxP间的DNA序列反转;(3)基因易位(translocation):两个LoxP位于不同DNA链上,则Cre促使不同DNA链发生LoxP间的DNA序列交换或易位。

       

(Annu Rev Genomics Hum Genet. 2006; 7: 247–276.)

3. Cre-LoxP系统在基因模式动物中的应用

相比于传统的转基因动物,Cre-LoxP系统可以利用组织特异性Cre的表达,实现组织特异性的基因编辑,常见有如下两种:

1. 组织特异性基因敲除

首先构建Flox小鼠(Flanked by LoxP),即在小鼠需要编辑的DNA序列两端插入两个同向的LoxP位点;该小鼠与组织特异性Cre鼠杂交(特异性启动子等因素,导致的组织特异性表达Cre的小鼠);子代鼠就会在特异性的组织表达Cre酶,从而在特异性的组织细胞中切除目标DNA序列。

       

(Lab Anim Res. 2018 Dec; 34(4): 147–159.)

2. 组织特异性基因插入

首先我们要了解特异性基因插入的位置,最早是使用随机转基因技术,但是随机转基因技术造成基因整合位点的随机不确定,导致小鼠表型的不稳定。之后,研究人员发现了Rosa26位点,即位于小鼠6号染色体上的非编码基因,该DNA区域不表达功能性蛋白,同时容易进行基因编辑操作,且插入基因后尚未发现对其他基因功能发挥的干预,因此Rosa26位点就成为基因插入的理想位置。

在Rosa26位点插入目的DNA序列(一般位于限制性酶切位点处),同时一般内源性Rosa26位点启动子活性不足,常常引入外源性启动子或增强子(CAG等)来促使目的基因的高表达,那么如何诱导组织特异性基因插入呢?

研究人员会在目的序列的上游插入“终止盒”(STOP casscatte,三个聚腺苷酸位点构成),并在两侧插入特异性LoxP位点。通常情况下,STOP会阻遏目的基因的表达,而在特异性组织细胞内的Cre催化下,则小鼠特异性组织细胞内STOP即被切除,因此实现目的基因的组织特异性表达。

       

(J Biomed Res. 2021 Mar; 35(2): 76–90.)

4. 诱导性Cre-LoxP系统

除了上文的组织特异性基因编辑,研究人员利用Cre-LoxP继续开发了时间特异性基因编辑,可以通过特定药物的和Cre的结合,来发挥Cre的功能,从而控制Cre-LoxP系统在特定时间发挥基因编辑作用,故称为诱导性Cre-LoxP系统。

1. Tam 诱导型Cre系统

该系统利用他莫昔芬(Tam)与雌激素受体(ER)-Cre融合蛋白的相互作用来调控Cre功能。当Tam缺失时,Cre-ER融合蛋白可以与热休克蛋白90(HSP90)结合,从而滞留在细胞质中,不能入核发挥重组酶作用;给予Tam后,Tam与ER作用,破坏HSP90对Cre的滞留,从而Cre核易位,进而在特异性LoxP位点发挥基因编辑作用。

       

 (Lab Anim Res. 2018 Dec; 34(4): 147–159.)

2. Dox诱导型Cre系统

该系统利用四环素衍生物(Dox,强力霉素)与四环素控制反式激活因子(tTA)或反向四环素控制反式激活因子(rtTA)相互作用,从而调控带有四环素响应元件(TRE)的Cre基因表达,发挥Cre-LoxP的诱导作用,主要有如下两类:

Tet-off系统,该系统中存在普遍表达或组织特异表达的tTA,当Dox缺失时,tTA处于激活状态,能够结合TRE诱导Cre表达,进而在特异性LoxP位点发挥基因编辑作用;当Dox存在时,Dox能够结合tTA,抑制其活性,故而阻遏其最TRE的结合,故而阻遏Cre表达。

Tet-on系统,该系统中存在普遍表达或组织特异表达的rtTA,当Dox缺失时,rtTA处于失活状态,无法结合TRE,从而Cre表达处于沉默状态;当Dox存在时,Dox能够结合激活rtTA,从而活化的rtTA结合TRE,进而促使Cre表达,进而在特异性LoxP位点发挥基因编辑作用。

       

(J Biomed Res. 2021 Mar; 35(2): 76–90.)

5. Cre-LoxP系统现有缺陷

Cre-LoxP系统虽然功能强大,但依然有一些缺陷需要大家在实验中注意,主要包括:

1. Cre的非特异性表达。Cre-LoxP发挥条件性基因编辑的重要前提就是Cre的特异性表达,但是有一些Cre鼠并不是高效和组织器官特异性的,即其他组织中也有Cre的表达,从而基因编辑存在脱靶,同时同一Cre鼠的雌雄遗传也会影响Cre的表达,因此我们在选择Cre鼠时,要仔细阅读说明书和查阅文献。

2. Cre的插入毒性。Cre插入基因组,可能会对内源基因表达产生影响,可能会影响组织细胞表型,干扰实验结果,甚至发挥毒性作用,因此预实验和充分的对照组必不可少。

3. Cre的重组效率不确切。Cre的作用并非100%,嵌合鼠依然有概率存在(即鼠的部分细胞发挥Cre-LoxP基因编辑,部分细胞组织不受影响);Cre对不同LoxP位点的重组效率不同;Cre对不同基因上的同一LoxP位点的重组效率也会有差异;LoxP位点在DNA上的距离、空间位置也影响Cre的重组作用。故我们在设计flox鼠时,要充分考虑LoxP位点选择及基因的空间结构和大小长短。

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