肿瘤与肿瘤干细胞研究文献解读

由于无症状进展、分子异质性和早期扩散,胰腺上皮内瘤形成是95%的胰腺癌患者患病的主要原因。而在胰腺癌中频繁出现的高耐药性,高复发性等预后不良因素,都将矛头指向了胰腺癌中存在的肿瘤干细胞。癌症干细胞(CSCs)代表肿瘤内具有自我更新能力的一小部分细胞,其主要有助于癌症的发生、发展和转移。今天就给大家带来一篇肿瘤与肿瘤干细胞的研究,这篇文章发表在Cancer Research(2021即时IF=12.7)上。文章立足于临床于基础的结合,从临床病例出发,研究思路也清晰明了。对于临床和基础的各位小伙伴参考模仿都非常容易。

1.Muc5ac的基因缺失延缓胰腺肿瘤性病变的发生和发展

 

为了探讨Muc5ac在胰腺癌(PC)发病和进展中的作用,作者首先发现与对照小鼠相比,Muc5ac敲除小鼠(KO)中保留了更大百分比的正常实质,肿瘤病变频率明显较低,表明PC发病延迟。在不同的进展周对PanIN病变进行分级。在KO小鼠中度和高度损伤百分比持续降低。接下来,作者从对照和KO小鼠胰腺中产生了3D类器官。结果发现KO类器官在培养15天后生存被抑制,而对照类器官则相反,KO组大小也减少了50%,这表明了Muc5ac在恶性细胞持续存活中的作用。此外,KO类器官显示了复杂的乳头状结构、核异型性等晚期组织学变化。

结论:Muc5ac基因可以维持胰腺癌肿瘤的生长。

               

2.MUC5AC的消除降低了小鼠和人PC细胞的肿瘤胰腺的干细胞性

 

为了确定Muc5ac促进PC进展的潜在下游靶点,作者对对照和KO鼠进行了RNA测序。下调基因与肿瘤干细胞(CSC)维持和上皮-间质转化(EMT)相关,qRT-PCR验证。免疫荧光研究显示KO胰腺中Klf4+导管上皮细胞减少,Muc5ac和Klf4表达呈强正相关。同时肿瘤干细胞标志物Aldh1a1和EpCAM显著减少。接下来,作者想要探究人PC细胞中是否存在MUC5AC介导的癌细胞干细胞富集。作者首先发现MUC5AC在人胰腺癌细胞系中高表达。将MUC5AC在PC细胞系中稳定敲降后,显示肿瘤细胞的百分比显著下降。敲降细胞系中干细胞标记物Aldh1a1、Sox9、Klf4、EpCAM、CD133和CD44的表达减少进一步证实了这一点。

结论:MUC5AC是维持胰腺癌干细胞的重要基因。

               

 

3.MUC5AC的沉默在体外和体内显著降低了PC细胞的致瘤倾向

 

越来越多的证据支持干细胞在肿瘤发生和转移中的作用。MUC5AC沉默后肿瘤细胞表现出G1/S阻滞,同样细胞周期调节因子也被下调。在软琼脂实验中,MUC5AC敲降的细胞形成的菌落明显较少。此外,通过MTT法发现MUC5AC的敲降降低了细胞活力。将敲降细胞原位植入裸鼠胰腺显示出肿瘤重量显著降低,增殖性Ki67+细胞百分比的明显下降。为了解决MUC5AC增强癌细胞致瘤潜能和增殖指数的能力是否依赖于CSCs的维持,作者进行了体外和体内限制性稀释试验。结果发现敲降细胞表现出干性成球能力的显著下降。细胞稀释度越低,集落大小的减少越明显,皮下成瘤实验证明上述结果。对照细胞在植入后35天可形成肿瘤,但敲降细胞未检测到肿瘤,这表明肿瘤起始CSC群体在MUC5AC存在下富集。

               

 

作者进一步通过RNA—seq表明KO小鼠EMT相关基因下调,MUC5AC敲降影响PC细胞的迁移,通过transwell迁移试验、伤口愈合试验和phalloidin染色的肌动蛋白聚合实验证实。此外,敲降细胞的原位肿瘤小鼠腹膜、肠、膈肌、肝、肺和肠系膜淋巴结的转移发生率降低。通过GSEA分析显示,对照小鼠胰腺组织中参与细胞迁移的基因显著富集。MMP-2和MMP-9是KO小鼠中肿瘤中最高的显著下调基因。敲降MUC5AC肿瘤中MMP-2和MMP-9的表达显著降低。同样在明胶酶谱中观察到MMP-2和MMP-9的活性增强。

结论:MUC5AC加强了CSC的维持,表达MUC5AC的PC细胞具有高致瘤性和高转移性倾向。

               

 

4.MUC5AC通过整合素β5促进PC细胞的致瘤潜能

 

随后,作者通过GSEA分析发现在KO鼠肿瘤中,MUC5AC的缺失显著影响整合素介导的信号传导。GO分析也显示整合素介导的细胞粘附高度富集。在之后的实验验证发现MUC5AC-KD细胞中整合素αv和β5显著缺失,同时MUC5AC的KD降低了酪氨酸416 (Y416) (26)的Src磷酸化,MUC5AC沉默显著降低了STA T3在酪氨酸705 (Y705)的磷酸化。定量来看,MUC5AC消融后整合素β5、pSrc和pSTA T3水平显著且持续下降。随后作者用对照细胞的条件培养基处理敲降细胞,结果基本上挽救了敲降细胞中整合素β5的表达。MUC5AC在纤连蛋白包被的平板上可以共免疫沉淀整合素β5,而敲降细胞则显著减少,在用对照培养基处理后,敲降细胞附着和增殖急剧增加。同时整合素β5的瞬时KD也显著损害了PC细胞的迁移潜能。MUC5AC和整合素β5的联合敲降完全消除了PC细胞的运动性。对人PC组织中MUC5AC和整合素αv和β5的免疫组织化学分析显示它们在PanINs以及高分化和低分化肿瘤中的空间共表达具有临床相关性。

结论:MUC5AC和整合素αv和β5的表达呈强正相关并且与PC细胞高致瘤性相关。

               

 

5.MUC5AC/整合素β5/pSTAT3轴上调KLF4表达维持PC干细胞性

 

最后在MUC5AC过表达和KD细胞中瞬时敲除整合素β5。结果发现STA T3磷酸化受到影响。同样发现pSTAT3在KO鼠胰腺肿瘤组织中的表达显著减少,MUC5AC和pSTAT3的表达具有显著相关性。接下来,用STA T3磷酸化抑制剂C-1889处理过表和敲降细胞,结果发现显著降低了表达MUC5AC的细胞的迁移倾向。此外,作者观察到原位肿瘤组织中MUC5AC的表达与pSTA T3 和Klf4的表达呈强正相关。作者瞬时敲除敲降细胞中的Klf4,发现在Klf4 KD时,肿瘤干细胞基因Aldh1a1的表达减少。在用来自对照细胞的条件培养基处理后,在敲降细胞中Klf4和Aldh1a1上调。

结论:MUC5AC通过激活STAT3磷酸化促进KLF4来维持PC细胞的干性,促进肿瘤的发生。

               

 

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