文献解读:如何用CRISPR技术结合生信分析发表高分文章

2020年诺贝尔化学奖颁发给火热的CRISPR基因编辑系统技术,以表彰法国生物化学家Emmanuelle Charpentier和美国生物化学家Jennifer Doudna在基因编辑方面做出的杰出贡献。目前基因编辑的技术很多,例如基因定位,表观遗传修饰,单碱基基因编辑系统、CRISPR/C2c2基因突变检测系统等等。但CRISPR/Cas9系统还是最简单实用,应用更加便捷广泛,目前该技术已经成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌等基因组的精确修饰。今天万事君以Cancer Cell (IF:31.7)期刊上文章“Multi-phenotype CRISPR-Cas9 Screen Identifies p38 Kinase as a Target for Adoptive Immunotherapies”(多表型CRISPR-Cas9筛查确定p38激酶为过继免疫疗法的靶点)为例,阐述如何用CRISPR技术结合生信分析来发表高分文章的研究思路,值得学习借鉴。

研究背景

使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因修饰的过继性T细胞转移免疫疗法(ACT)可以诱导使治疗难治的转移性人类肿瘤完全和持久消退,近年来已有基于T细胞的多种癌组织学治疗成功的报道,比如:CAR-T免疫治疗,这些过程中T细胞筛选是关键步骤,维持T细胞的适应性、扩增分化等特性对增强T细胞的抗肿瘤效果非常重要,然而目前的干预药物却往往只对一种因素作用。本文献的研究试图通过CRISPR/Cas9文库筛选结合生物信息学分析找到既能增强T细胞多种治疗有效抗肿瘤的分子靶标,同时又能保留新抗原特异T细胞群落的药物靶点。

 

研究方法

 

CRISPR文库筛选是指将不同基因的sgRNA(与DNA互补的向导RNA)转入特定细胞,实现目的基因敲除,再根据需要进行表型筛选、测序,从而挖掘到与表型相关的基因。因为T细胞是免疫治疗的核心,因此首先作者在过继性T细胞转移免疫疗法的T细胞培养过程中,用CRISPR-Cas9的原代T细胞遗传筛选,同时利用荧光激活细胞分选术筛选敲除后能提高T细胞杀伤肿瘤能力的细胞:TCR激活的小鼠CD8+T细胞。

       

接着便是利用CRISPR构建包含25个激酶的使用文库:其中每个激酶设计3条sgRNA,4个表型分为4组,每组设置2个重复。选取无靶向(阴性对照)和阳性对照的sgRNA加入库中进行CRISPR文库筛选。

       

正如开头CRISPR文库筛选的定义所言,将sgRNA转入特定细胞后需要对CRISPR文库筛选表型。于是作者利用流式细胞仪对细胞增长、细胞干性、氧化压力(ROS)等标志性表型细胞进行筛选,结果显示分选表型为细胞增长加快、CD62L上调,ROS和γH2AX下调的T细胞。

       

既然表型确定了,作者另辟蹊径通过测序及生信分析对这四种表型进行分析,首先根据表型将测序结果分别排序;接着使用“基因多效性评分”方法进行打分;同时重复取交集、sgRNA标准等方法最终获得排名最高的激酶Mapk14(p38)。

       

既然表型确定后可以通过测序及分析能够挖掘得到p38基因,那么如果敲除p38基因,表型是否一致呢?于是作者进行了表型验证,同样通过sgRNA转染细胞敲除p38基因来验证4种表型变化,结果显示新sgRNA能有效敲除p38基因且4种表型变化与预期一致。

 

       

接着作者提出问题,既然表型一致,那功能是否一致呢?作者同样另辟蹊径进行验证,作者利用p38抑制剂(p38i)在体内外进行验证。

 

1. 体外验证:作者用p38i对细胞内ROS水平以及代谢物水平的谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等表达量进行验证,同时转染到T细胞进行转录测序分析,发现p38i可以下调ROS通路,更为关键是转录组分析显示与之前4种表型完全吻合。

       

2. 体内验证:作者用p38i培养黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞,结果显示T细胞增长加速、CD62L+细胞数量明显增多;同时作者利用基因工程培养T细胞,转染后发现效率不变,同时明显保留了CD62L+/CD8+/CTR+T细胞。

 

       

接着作者将p38i体外培养T细胞重新输回小鼠体内,发现预后效果良好,肿瘤缩小的同时小鼠生存期显著增加。这些表明p38i体外培养T细胞杀伤肿瘤的能力显著增强。

       

 

综上所述,通过体内外实验证实:CRISPR-Cas9筛查确定p38激酶能够作为过继免疫疗法的靶点。

 

启发学习

 

CAR-T免疫治疗已经为肿瘤治疗带来福音,本文追踪炙手可热的免疫治疗方向加上刚刚获得诺奖的CRISPR技术,再辅助生物信息学的基因表型分析,铸就了一篇顶刊文章,立意高远,借力巧妙,可谓题好一半文。另外从基因筛选到表型和功能验证完整,生信分析同样占据大半功劳。当然,细胞模型选择、sgRNA设计等等也很重要,但万事君想说,好的Idea(火热的研究方向,像肿瘤治疗、靶向、生物标志物等)+好的手段(像CRISPR技术、组学分析等),再辅助常规的生信分析就能发表很不错的文章,你学会了吗?

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