m6A在白血病中的研究

急性髓系白血病(AML)是一种致命的造血系统恶性肿瘤。白血病干细胞/祖细胞(LSCs/LICs)以其无限的自我更新被认为是疾病起始和进展的根本原因,也是AML治疗失败和复发的根本原因。有报道研究m6A基因修饰参与了许多的生理和病理过程,包括造血和白血病发生。N6-甲基腺苷(m6A)是最丰富的内部mRNA修饰,m6A主要是由甲基转移酶METTL3和METTL14等组成的m6A甲基转移酶复合物而发挥作用。m6A去甲基化酶包括FTO和ALKBH5可以去除m6A甲基化修饰。今天小编就带来一篇m6A在白血病中的研究,这篇文章发表在cell stem cell(2020即时IF=24.6)上,全文思路清晰,对于下游基因验证详实,值得大家参考学习。

       

1.ALKBH5在急性髓系白血病中过度表达且与患者预后不良相关

 

首先作者基于急性髓系白血病患者队列和一个正常对照队列的基因表达谱数据集,观察到与正常造血干细胞(HSC)对照组相比,ALKBH5在急性髓系白血病的各种亚型中的表达水平明显更高。蛋白水平同样验证,TP53 WT和突变AML细胞系中,ALKBH5的水平高于正常对照细胞。此外,急性髓系白血病患者较高的ALKBH5表达与较短的总生存期(OS)相关。

结论:ALKBH5与临床白血病相关,且高表后预后不良

 

2.人急性髓细胞白血病细胞生长需要碱性磷酸酶5

 

为了研究ALKBH5在急性髓系白血病中的作用,进行了功能获得和丧失研究。通过shRNAs敲降ALKBH5导致人AML细胞生长抑制,细胞凋亡显著增加,以及m6A水平的显著增加,而将ALKBH5过表后结果与此相反在TP53 WT和TP53突变体的AML细胞系中ALKBH5表达的操纵无明显差异,这表明ALKBH5在AML细胞中的作用不依赖于TP53突变状态。最后作者使用条件敲除和稳定KO细胞也发现上述表型。

结论:ALKBH5敲除后影响AML细胞的生长,凋亡和m6A水平

       

 

3.癌基因诱导的细胞永生化和白血病发生需要ALKBH5

 

随后作者构建了ALKBH5的敲除小鼠,通过液相色谱-质谱 (LC-MS/MS)检测,观察到KO鼠的BM中的m6A丰度显著增加。同时作者使用MA9转化正常HSPCs并快速诱导小鼠AML构建细胞转化(集落形成/永生化)和白血病发生模型。作者通过体外集落形成/置换试验(CFAs)检测发现Alkbh5 KO鼠显著抑制了细胞永生化,WT鼠结果相反。为了评估Alkbh5在体内白血病发生中的作用,作者进行了小鼠骨髓移植(BMT)试验。结果表明Alkbh5 KO鼠显著延迟了白血病的发作,并以剂量依赖的方式延长了受体小鼠的生存期,并且显著抑制了MA9转化供体细胞在受体外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏中的植入,导致白细胞(WBC)计数、脾脏重量、肝脏重量、PB和BM中未成熟的原始细胞群以及脾脏和肝脏中白血病浸润的显著减少。

结论:ALKBH5可以显著介导细胞永生化并促进小鼠白血病的发生

       

4.碱性磷酸酶5表达缺失损害急性髓系白血病细胞增殖和急性髓系白血病维持

 

为了确定ALKBH5是否也是维持AML所必需的,作者在白血病细胞中敲除Alkbh5后所有AML亚型模型中显著抑制了集落数量、集落大小和细胞数量。二级BMT分析表明,敲除Alkbh5显著损害受体小鼠MA9诱导的急性髓系白血病的进展。之后作者进行了体外CFA和体内异种移植模型实验,结果发现无论是稳定还是诱导ALKBH5敲除都显著减少了人AML细胞的集落数量和大小。此外,在异种移植受体小鼠中,敲除ALKBH5显著延缓了人类急性髓系白血病的进展并延长了生存期。ALKBH5敲除还显著抑制人原代AML细胞生长和集落形成能力,并促进人大量AML细胞和CD34+细胞的凋亡。

结论:ALKBH5是维持急性髓系白血病所必需的。

       

5.ALKBH5表达的缺失损害了LSC/LIC的自我更新

 

为了评估ALKBH5在白血病干/祖细胞(LSC/LIC)自我更新中的作用,作者发现在MA9转化的HSPCs中,Alkbh5 KO显著抑制细胞生长并促进细胞凋亡。在体内BMT分析中,我们观察到Alkbh5 KO组中白血病粒细胞-单核细胞祖细胞群(L-GMP)的比例明显低于WT组,同时前者的L-GMP细胞凋亡率更高。接下来作者发现Alkbh5 KO显著抑制了体内原发性AML细胞的再增殖能力,表明LSC/LIC的再增殖需要Alkbh5。为了定量评估Alkbh5耗竭对LSC/ LIC自我更新的影响,作者进行了体内外限制性稀释试验(LDAs),结果发现敲除Alkbh5显著降低LSC/LIC频率。、

结论:LSC/LIC自我更新需要ALKBH5。

 

6.Alkbh5缺失不会显著影响正常造血

 

作者在正常小鼠和转基因小鼠中发现分化谱系细胞没有显著变化,在稳定状态下,Alkbh5缺失对HSPC稳态和多系造血没有明显影响,也不会影响长期体外培养HSPC。体内竞争分析Alkbh5缺失后不同血细胞谱系在大多数时间点上没有表现出显著差异,转基因小鼠的骨髓细胞显示出稍高的重建能力以及一些祖细胞群体和KO组中所有分化群体的轻微增加,表明Alkbh5缺失导致祖细胞和分化细胞轻微扩增。

结论:ALKBH5可能会发挥作用在应激状态下维持造血中正常HSC自我更新的次要作用。

       

7.急性髓系白血病中ALKBH5潜在靶点的鉴定

 

为了揭示ALKBH5在急性髓系白血病中的作用机制,作者进行了转录组RNA测序(RNA-seq)、RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)和m6A测序(m6A-seq)。RNA-seq显示,在敲除ALKBH5后,差异基因富集到凋亡和p53通路,同时有丝分相关通路显著抑制。RIP-seq揭示了绝大多数ALKBH5结合位点位于蛋白质编码转录物中,并鉴定出潜在直接靶标,这些靶标富含细胞周期和增殖相关途径。m6A-seq数据显示,绝大多数m6A峰分布在mRNA转录物的蛋白质编码区(CDS)和3’非翻译区(3’UTR)。随后作者通过整合分析RNA-seq、RIP-seq和m6A-seq数据,确定了ALKBH5在AML中的18个潜在靶点,并且利用RIP-qPCR、m6A-qPCR和qPCR验证结果。之后作者有比较了另一种m6A eraser FTO,结果发现ALKBH5敲除后有更多基因下调。在这些基因中,ALKBH5和FTO共有119个下调基因和251个上调基因。而18个潜在目标中只有MCM7和TFEB也是FTO的潜在目标。

结论:利用三种测序发现潜在靶基因及验证ALKBH5与凋亡和细胞周期有关。

       

8.TACC3是ALKBH5在急性髓系白血病中的重要靶点

 

作为ALKBH5的靶点,TACC3在急性髓系白血病中显示出预期的不良预后影响,并且与ALKBH5的表达呈显著正相关,TACC3转录物也与ALKBH5的最大富集相关, qPCR验证了TACC3在ALKBH5敲除时表达水平显著降低和m6A丰度增加。作者首先证实ALKBH5敲除显著降低TACC3水平,而过表达ALKBH5会增加TACC3的表达。此外,作者发现TACC3的表达在急性髓系白血病细胞中没有被FTO敲除显著抑制。因此表明TACC3是急性髓系白血病中ALKBH5的一个特定靶点。据报道m6A修饰会影响mRNA的稳定性和翻译。同时作者发现ALKBH5的敲除导致细胞中mRNA转录物的半衰期缩短。作者证实ALKBH5敲降后显著降低了TACC3 mRNA半衰期,而ALKBH5的过表达显著增加了TACC3mRNA半衰期。因此, ALKBH5有可能通过影响mRNA的稳定性来调节其靶标的表达水平。此前有报道称TACC3可调节正常细胞或癌细胞中的MYC和P21水平。作者也同样发现,ALKBH5敲除不仅导致TACC3抑制,而且导致MYC减少和P21增加。

结论:ALKBH5/m6A/TACC3轴也调节急性髓系白血病细胞的P21和MYC通路。

       

因此,作者开始研究ALKBH5的直接靶点TACC3的功能重要性。首先TACC3敲除也显著抑制人AML细胞的生长并诱导凋亡,Wb证明MYC水平显著降低,P21水平升高。同时发现敲除TACC3可以极大地抑制小鼠MA9 AML细胞的生长和集落形成/再生能力。体外LDAs证明,Tacc3敲除显著降低了LSC/LIC频率。此外,通过过表达TACC3,可以挽救ALKBH5敲除对细胞生长的抑制作用,这伴随着MYC表达的恢复和P21的减少。结论:TACC3是ALKBH5在急性髓系白血病中真正的重要功能靶点。

       

研究思路

       

文献解读

肿瘤免疫治疗文章思路

2021-10-8 22:37:20

文献解读

无代码生信分析肿瘤免疫浸润研究思路

2021-10-8 22:40:24

声明 本网站部分文章源于互联网,出于传递更多信息和学习之目的转载,并不保证内容正确或赞同其观点。
如转载稿涉及失效、版权等问题,请立即联系管理员;我们会予以修改、删除相关文章,请留言反馈
Notice: When your legal rights are being violated, please send an email to: sci666net@qq.com.
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
购物车
优惠劵
今日签到
有新私信 私信列表
搜索