生信分析结合基础实验

众所周知,上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用,其有助于细胞的迁移,因此探索EMT关键分子和靶向EMT关键分子的手段便成为研究肿瘤转移机制的关键。今天万事君以 “Non-canonical signaling pathway of SNAI2 induces EMT in ovarian cancer cells by suppressing miR-222-3p transcription and up-regulating PDCD10”的高分文章来讲解一下从miRNA角度解读EMT调控机制,简单易学,定能收获满满。

       

研究背景

 

上皮性卵巢癌是全球女性最致命的恶性肿瘤之一,其一般的高死亡率是由于晚期出现的最致命的癌细胞侵入邻近器官或转移到腹腔。众所周知,SNAI2可以抑制E-cad的表达,从而诱导上皮-间充质转化(EMT),然而目前导致上皮性卵巢癌细胞转移的潜在分子机制尚不清楚。本文作者之前的研究报告称,miR-222-3p是上皮性卵巢癌细胞发生和扩散的重要肿瘤抑制miRNA,本研究旨在更深入地了解miR-222-3p调节可能有助于改善上皮性卵巢癌当前抗转移策略的作用机制。

 

研究方法

 

作者的前期报道称,miR-222-3p可通过靶向GNAI2抑制上皮性卵巢癌肿瘤细胞增殖,还有研究描述miR-222-3p通过靶向ERα促进子宫内膜癌细胞增殖和肿瘤转移。然而miR-222-3p抑制EOC细胞迁移的确切机制尚不明确。于是首先作者体外对上皮性卵巢癌组织和健康组织中miR-222-3p的表达量进行分析并对多种上皮性卵巢癌细胞系(A2780、HO 8910、HO 8910 PM和SKOV3)的miR-222-3p的表达量进行分析,结果显示miR-222-3p在上皮性卵巢癌组织中显著低表达。

 

       

 

接着作者使用在线生物信息学软件miRDB 、TargetScan 、PicTar和miRTarbase来预测可能被miR-222-3p靶向的候选基因,通过比较两个或两个以上相交的亚群,确定了262个候选基因。随后采用GO和KEGG通路富集分析对这262个基因进行了分析,并通过GO分析发现与“癌症中的miRNA”通路存在显著相关性,通过敲除和过表达细胞中的miR-222-3p,分析表达情况。预测结果表明:miR-222-3p能够与PDCD10蛋白结合。体外qPCR、Western Blot等实验同样证实细胞中PDCD10与miR-222-3p表达相关。

       

为了进一步确定相关性,作者分别从上下游通过数据集分析发现:E-cad与PDCD10表达呈现负相关,同时下游发现miR-222-3p启动子区有转录因子SNAI2的结合位点。

 

       

 

以上的种种实验是为了一个合理的科学假设,于是作者做出科学假设:转录因子SNAI2可以抑制miR-222-3p的转录, miR-222-3p通过靶向PDCD10抑制 EMT和β-catenin/ Wnt信号通路,从而抑制上皮性卵巢癌细胞的迁移。

 

既然作出假设接下来就开始正式实验进行验证,首先通过Transwell等实验说明miR-222-3p能够抑制上皮性卵巢癌细胞迁移,接着为了验证miR-222-3p是否能够通过靶向PDCD10在体内抑制上皮性卵巢癌细胞转移,作者将GFP标记的LV-miR-ctrl/LV-miR-222-3p和GFP标记的ctrl载体/PDCD10过表达稳定细胞注入裸鼠腹部,构建异种移植模型,结果显示:与LV-miR-222-3p和ctrl载体共转染的HO 8910 PM细胞组在肿瘤异种移植模型中的转移率显著低于OE-PDCD10和LV-miR-222-3p共转染组,从而说明PDCD10表达的恢复逆转了miR-222-3p对肿瘤转移的抑制作用。同时对从肿瘤中提取的蛋白进行Western blot、免疫组化等分析,结果显示PDCD10过表达载体有效恢复了其在上皮性卵巢癌转移结节中被miR-222-3p抑制的蛋白水平。

 

       

成功验证miR-222-3p能够通过靶向PDCD10在体内抑制上皮性卵巢癌细胞转移,那么与EMT有什么关系呢?于是作者利用免疫荧光进行定位分析,结果显示PDCD10过表达能影响表达E-cad和VIM的细胞形态和空间位置变化。同时定量实验表明miR-222-3p/PDCD10调控轴与卵巢癌转移呈负相关,这些说明miR-222-3p靶向PDCD10,通过EMT途径抑制细胞迁移。

 

       

 

既然miR-222-3p靶向PDCD10,通过EMT途径抑制细胞迁移,作者又提出疑问,进一步细化是通过何种方式影响EMT?于是作者利用双荧光素酶报告系统进行分析以及其他GSEA富集等分析说明Wnt /β-catenin信号通路参与了PDCD10调控的上皮性卵巢癌转移。

 

       

紧接着作者根据JASPAR数据库,确定miR-222-3p启动子上存在潜在的SNAI2结合位点,发现SNAI2在转录水平上抑制miR-222-3p,导致体外上皮性卵巢癌细胞迁移增加。

 

       

最终得出与之前科学假设的相同结论:转录因子SNAI2可以抑制miR-222-3p的转录,miR-222-3p通过靶向PDCD10抑制 EMT和β-catenin/ Wnt信号通路,从而抑制上皮性卵巢癌细胞的迁移。

 

最后万事君用一张整体图呈现如下,希望有助于全文把控。

 

              

  

启发学习

 

本文从miRNA角度阐明上皮性卵巢癌中EMT的调控机制,思路清晰、逻辑严谨、实验详实,既有生物信息学知识,又有实验,这个发文思路值得我们学习和品鉴

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