国自然之miRNA在外泌体研究思路

近几年外泌体研究持续升温,有关外泌体载药、诊断、免疫等方向的论文相继登上CNS舞台,同时外泌体作为国自然热门方向,项目中标和资助数目也是逐年水涨船高。

今天我们以Nature Communications上题为“Cancer-derived exosomal miR-25-3p promotes pre-metastatic nicheformation by inducing vascular permeability and angiogenesis”来一探miRNA在外泌体研究中的思路,简单易学,便于掌握。

研究背景

肿瘤细胞的转移需要周围微环境的支持和协助,特别是新血管生成,而外泌体在肿瘤微环境对增加血管通透性起到重要作用,能够促进肿瘤细胞的转移。已有研究表明在肿瘤血管生成信号通路中,HIF-1可以诱导VEGF和B-FGF蛋白,增加血管渗透性并促进血管内皮细胞生长,从而引导新血管的形成。因此,识别参与肿瘤微环境中转移前生态位形成的生物标志物,对肿瘤转移的诊断、预后和干预具有重要价值,而miRNA具有潜在的生物标记物的功效

研究思路

首先为了确定结直肠癌中潜在的转移相关miRNA,使用结直肠癌组织(有无转移两种)和相应的正常粘膜进行miRNA比较。在不同表达的微小核糖核酸中,六种微小核糖核酸(miR-221、miR-92a、miR-92b、miR-25-3p、miR-1246和miR-371-5p)在有转移的结直肠癌组织中与无转移的结直肠癌组织相比显著上调。对27对新鲜结直肠癌组织的逆转录聚合酶链反应分析表明,在6种候选微小核糖核酸中,miR-221、miR-92a、miR-25-3p和miR-1246在结直肠癌组织中显著上调,最重要的是,miR-25-3p水平与转移密切相关

此外,与正常人结肠粘膜上皮细胞系NCM460相比,miR-25-3p在五种结直肠癌细胞系中明显上调。荧光原位杂交分析显示miR-25-3p在结直肠癌上皮和间质中均有表达,这与以前的研究一致,同时结直肠癌细胞中miR-25-3p(红色)的水平(用CK标记,紫色)与癌旁内皮细胞中miR-25-3p的水平(用CD34标记,绿色,)呈正相关。

确定miR-25-3p后紧接着验证是否可以通过外泌体从结直肠癌细胞转移到内皮细胞,即是否与肿瘤转移相关。为了解决这个问题,miR-25-3p在结直肠癌细胞中过度表达或被敲除,同时提取外泌体进行蛋白质印迹显示囊泡对外泌体标记CD63和TSG101呈阳性。接着逆转录聚合酶链反应显示结直肠癌细胞中miR-25-3p的过度表达或敲除分别导致外体miR-25-3p的上调或下调。此外,将人脐静脉内皮细胞与来源于SW480细胞的PKH67标记的外泌体孵育,该外泌体用Cy3标记的miR-25-3p模拟物转染。结果在孵育的人脐静脉内皮细胞中观察到Cy3荧光和PKH67脂质染料,这些结果表明miR-25-3p包含在癌症分泌的外泌体中,并可转移到人脐静脉内皮细胞

至此发现结直肠癌(CRC)衍生的外泌体miR-25-3p,并且可以通过外泌体途径转移至血管内皮细胞中,那么在内皮细胞如何作用呢?会不会促进血管生成呢?于是作者开始进行下一步探究,为了探讨外体miR-25-3p对内皮细胞的影响,作者检测了SW480/miR-25-3p外泌体是否促进人脐静脉内皮细胞的迁移,结果发现用SW480/miR-25-3p外泌体治疗显著促进人脐静脉内皮细胞的迁移,用人脐静脉内皮细胞/miR25-3p外泌体治疗对结直肠癌细胞的迁移没有影响。接着进行试管形成试验、主动脉环试验和体外通透性等试验,以检测外体miR-25-3p是否调节血管通透性和血管生成。与对照组相比,SW480/miR-25-3p或NCM460/miR-25-3p的外泌体明显促进血管通透性和血管生成。相反,HCT116/zip-miR-25-3p外泌体抑制血管通透性和血管生成。

为了实验更严谨,作者进一步确定外泌体miR-25-3p是否参与血管渗漏和血管生成,结果表明,外泌体miR-25-3p诱导的血管通透性和血管生成被miR-25-3p抑制剂消除,此外,转染miR-25-3p模拟物的SW480/模拟外泌体显著促进血管通透性和血管生成。这些表明来源于结直肠癌细胞的外体miR-25-3p破坏了内皮屏障的完整性,并诱导血管生成

至此,文章基本完整闭环,可以投稿5分上下的期刊。但是想发高分文章必须有锦上添花的秘诀,即:在miR-25-3p在内皮细胞中是如何促进血管通透性和血管生成的?接下来是机制的探究。为了探索miR-25-3p如何调节血管通透性和血管生成,采用了四种miRanda、miRDB、miRWalk和Targetscan预测算法来确定miR-253p的潜在下游靶点。在潜在目标中,KLF2和KLF4在所有数据库中是重叠的。同时有文献报道,KLF2通过抑制VEGFR221的启动子活性来抑制血管生成,KLF4被认为对内皮屏障的完整性至关重要,因为它增强了紧密连接相关蛋白的启动子活性,包括ZO-1、occludin和Claudin522。于是,作者站在前人肩膀上进一步探究,为了评价KLF2和KLF4在血管通透性和血管生成中的作用,进行了体外通透性试验和成管试验,同时沉默人脐静脉内皮细胞中的KLF2和KLF4进行反向探究最终发现机制——miR-25-3p靶向KLF2/4调节VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5在内皮细胞中的表达,从而促进血管通透性和血管生成。

思考学习

整篇文章逻辑严谨,从确定关键miRNA并实验验证,到经过外泌体途径转移至血管内皮细胞中,运用大量的实验技术佐证,最终发现miR-25-3p可以通过外泌体途径转移至血管内皮细胞中,并以靶向KLF2/4调节VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5在内皮细胞中的表达,从而促进血管通透性和血管生成,可以作为结直肠癌转移的生物标记物研究。值得我们模仿和学习,最后附一张整体流程。

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