m6A阅读器YTHDF1在肿瘤中通过m6A影响下游基因表达而促进肿瘤发生

N6-甲基腺苷(m6A)是真核细胞mRNA最普遍的内部修饰,几乎影响RNA代谢的各个阶段,包括剪接、输出和翻译。m6A RNA甲基化是由“编写者”METTL3、METTL14和WTAP组成的多组分蛋白质复合物催化的,两个去甲基化酶FTO和ALKBH5起“擦除器”的作用,负责去除mRNA上的m6A修饰。“写入器”和“擦除器”之间的相互作用决定了m6A修饰的动态性和可逆性,含有YT521-B同源(YTH)结构域的蛋白包括YTHDF1-3、YTHDC1和YTHDC2是特异性的阅读器识别m6A修饰位点。

 

今天笔者就带来一篇m6A阅读器YTHDF1在肿瘤中通过m6A影响下游基因表达而促进肿瘤发生的文章,这篇文章发表在Nucleic Acids Research(IF=11.5)上,在肿瘤研究中相对套路一些,但是对于m6A研究比较细致,运用了多种组学测序技术分析,干湿实验完整严谨,对于思路整理借鉴十分有帮助。

 

 

1.YTHDF1在卵巢癌中高表达

 

作者为了研究m6a相关基因在卵巢癌发生发展中的作用,首先作者利用TCGA数据库发现YTHDF1基因表达量显著升高,在已发表的数据中发现YTHDF1在卵巢癌中上调。生存分析发现YTHDF1高表达的卵巢癌患者的总生存期和无病生存期较差。随后采用RT-qPCR方法比较35例卵巢癌标本和12例正常卵巢表面上皮细胞发现卵巢癌组织中YTHDF1的表达显著增加。作者利用组织芯片技术验证同样结果。结论:YTHDF1在卵巢癌中过表达,与卵巢癌患者预后不良相关。

 

 

2.YTHDF1调控卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

 

随后作者构建了YTHDF1敲降卵巢癌细胞系。通过CCK8检测,YTHDF1的表达下调显著损害了敲降细胞的生长,同时,EdU染色显示敲降细胞增殖显著减少。集落形成试验表明,敲降YTHDF1 后明显抑制了集落形成。此外,划痕和侵袭实验表明,敲降细胞的迁移和侵袭能力减弱。结论:YTHDF1在卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥着重要作用。

 

3.YTHDF1缺失在体内抑制卵巢癌细胞的肿瘤发生和转移

 

为了评估YTHDF1在体内卵巢癌的致癌作用,作者采用皮下肿瘤模型和腹膜转移性异种移植瘤模型。裸鼠荷瘤实验证明敲降细胞组肿瘤明显减小,肿瘤体积和肿瘤重量均明显减少。敲降组的肿瘤显示出Ki-67信号降低,但caspase-3活性增加。腹膜转移模型结果发现YTHDF1沉默后,基本上取消了细胞在腹腔中形成二次肿瘤的能力。结论:YTHDF1在卵巢癌中通过调节细胞增殖和转移发挥致癌作用。

 

4.YTHDF1在卵巢癌中的靶点鉴定

 

为了探讨YTHDF1在卵巢癌发生发展中的潜在机制,作者首先进行RNA-seq,分析出差异表达基,并进行了GO分析富集到MAPK信号通路,肿瘤抑制和调节细胞迁移等。由于YTHDF1作为m6A的解读器,YTHDF1通过结合和影响m6A甲基化转录本发挥作用,因此作者利用m6Aseq从3990个基因中鉴定出8104个m6A峰。这些m6A修改主要位于蛋白质编码和停止密码子。RIPseq也显示了YTHDF1的1698个潜在候选靶点。随后做着将RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq进行交集发现YTHDF1结合的693个基因被m6A标记,其中647个基因在敲除YTHDF1后没有发生改变,功能注释显示,他们参与多种RNA代谢过程,包括翻译、mRNA剪接和RNA稳态。结论:与之前发现一致,YTHDF1没有影响其靶点的RNA丰度,而是通过与m6A修饰的mRNA相互作用来调控蛋白质合成。

 

5.EIF3C是YTHDF1的m6A修饰靶点

 

之后作者进行eCLIP -seq,鉴定出2343个靶向转录本,同时也分析出了m6A共识基序GGAC和YTHDF1的结合偏好。值得注意的是,通过重叠eCLIPseq和上述647个基因的结果,共鉴定出175个基因为YTHDF1的直接靶标,但它们的转录在YTHDF1敲除后没有发生改变。接下来,作者分析了175个ythdf1结合mrna中m6A峰和eCLIP峰的分布,发现,EIF3C的YTHDF1结合位点与m6A 位点吻合良好。eCLIP-qPCR也显示YTHDF1富集EIF3C mRNA最为显著。结论:EIF3C是YTHDF1在卵巢癌细胞中的一个直接靶点。

 

6.YTHDF1调控卵巢癌细胞中EIF3C的表达和整体翻译输出

 

作者首先发现YTHDF1缺失后降低了EIF3C的蛋白丰度,但不影响其RNA水平,RIP-qpcr证实了YTHDF1与EIF3C mRNA的相互作用。所以作者推测YTHDF1可能调节EIF3C的蛋白稳定性或翻译效率。随后作者利用用蛋白翻译抑制剂CHX处理敲降细胞。Wb显示敲除YTHDF1对EIF3C蛋白的稳定性无影响。之后,作者构建了YTHDF1-mut突变细胞使其不能与m6A结合。免疫沉淀反应显示突变体与EIF3C mRNA的结合明显减少。此外,作者又构建了EIF3C的m6A位点突变的突变体。Wb显示YTHDF1对EIF3C突变体的表达影响较小。接下来作者探究YTHDF1是否会影响卵巢癌细胞的整体翻译输,利用HPG掺入法分析了新的蛋白质合成,EIF3C敲除后,合成蛋白质的HPG减少。同样,YTHDF1缺陷细胞HPG信号下降,表明YTHDF1可以影响整体蛋白合成。结论:YTHDF1在卵巢癌细胞中通过调节EIF3C蛋白的表达促进整体蛋白合成。

 

7.EIF3C在卵巢癌细胞中起致癌作用

 

应用组织芯片技术检测发现EIF3C蛋白在卵巢癌组织中的表达并且卵巢癌中EIF3C蛋白表达明显升高。敲除EIF3C后的卵巢癌细胞生长、集落形成能力、细胞迁移和侵袭等表型被显著抑制。结论:EIF3C在卵巢癌细胞中促进肿瘤形成。

 

8.EIF3C的异位表达改善了YTHDF1缺失对卵巢癌细胞的抑瘤作用

 

接下来作者利用挽救实验在ythdf1敲降的卵巢癌细胞中过表EIF3C,YTHDF1基因敲低抑制细胞生长和集落形成,而EIF3C过表达则可以挽救,细胞迁移和侵袭能力也同样被挽救。这些结果表明EIF3C是YTHDF1促进卵巢癌进展的关键下游靶点。最后,作者分析了卵巢癌组织中EIF3C蛋白表达与YTHDF1蛋白表达的相关性,发现YTHDF1的蛋白丰度与EIF3C的表达呈正相关。结论:EIF3C对YTHDF1在卵巢癌中传递致癌信号至关重要,YTHDF1表达增加可通过调节EIF3C翻译来增强整体蛋白合成,并促进卵巢癌细胞的肿瘤发生。

 

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