解读miRNA结合肿瘤探索机制类文章

近年来miRNA文章可谓雨后春笋般遍地开花,在国自然项目申请上也不例外,miRNA类课题也常名列前茅。今天我们来解读一篇5分+的文章,方法典型,思路常规,适合学习模仿,让我们一起来汲取好文章的营养。

背景介绍

首先文章背景介绍胃癌作为一种高死亡率癌症的主要原因是依赖肿瘤血管生成的远处转移,而任何实体瘤的发生几乎都是基于血管的生成,其中血管内皮生长因子及其受体是肿瘤血管生成的关键。VEGFR包含三个亚型,即VEGFR-1(也称为FLT-1)、VEGFR-2(也称为KDR)和VEGFR-3;VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管内皮细胞中表达,VEGFR-3在淋巴管内皮细胞中高度表达。最近的研究表明,血管内皮生长因子受体-1和血管内皮生长因子受体-2表达已被证明与肿瘤远处转移有关,因此本文试图以血管内皮生长因子受体1/2为靶点,研究miR-590对胃癌血管生成、增殖、侵袭和转移的影响。

这类主题的文章背景介绍一般都很常规,目的是将想要研究的肿瘤和目的miRNA联系,并建立研究假说和突破口。

思路阐述

首先常规做法是通过找不同比较表达差异,找到关键的主变量miRNA。作者收集118例新鲜人体胃癌组织样本,通过核糖核酸提取检测、表达质粒转染构建等,并结合多个预测网站,对靶向VEGFR1、VEGFR2的miRNA取交集,结果显示共有14个miRNA;同时通过qRT-PCR检测正常胃黏膜细胞系(GES1)及胃癌细胞系(AGS、MKN45)中这14个miRNA的表达和过表达效率,并通过Western Blot验证只有miR-590可以均显著降低NRP1、VEGFR1、VEGFR2蛋白水平。这些结果说明miR-590在胃癌细胞中低表达,并且可以负调控NRP1、VEGFR1和VEGFR2。

以上是第一步,找到关键的主变量miR-590,当然,找差异过程除费力去找多个预测网站,还可以稳准狠进行基因测序,前提是不差钱(手动狗头)。

第二步接着进行一系列实验对已找出的miR-590和目的靶点VEGFR1、VEGFR2关系进行验证。

通过免疫荧光验证过表达miR-590可以降低VEGFR1、VEGFR2的表达,同时预测并通过荧光素酶报告分析miR-590可以与VEGFR1、VEGFR2的3‘-UTR结合。

第三步联系表型——胃癌细胞进行探究,既然miR-590和目的靶点VEGFR1、VEGFR2关系紧密,那么在特定的胃癌细胞中如何呢?

作者通过qRT-PCR验证发现:miR-590在胃癌细胞系中相较正常胃黏膜细胞系低表达,同时发现相较非转移性胃癌组织,miR-590在转移性胃癌组织中低表达。另外实验发现miR-590在胃癌组织中与VEGFR1/2呈负相关,且miR-590的低表达与预后不良相关。

既然miR-590影响胃癌及预后,那么是怎么影响的?第四步自然而然进行机制的探究。根据文献提示,作者对Snail、TWIST1、ZEB1三个转录因子进行表达探究,发现只有过表达Snail,miR-590的表达才会降低。同时实验发现Snail可以与miR-590的启动子结合,并且Ch-IP实验进一步说明Snail与miR-590启动子上的E-Box序列结合。

机制明白验证miR-590后,第五步作者试着过表达miR-590看看胃癌细胞到底会发生什么?通过CCK8、流式实验等结果发现,过表达miR-590不仅可以抑制癌细胞增殖,同时抑制癌细胞迁移、侵袭以及癌细胞凋亡。而过表达miR-590同时过表达VEGFR1/2可以使增殖、迁移、侵袭、凋亡的表型相反。同时作者又进行动物水平的验证,结论相同。

以上充分说明miR-590可以通过调控VEGFR1/2而调控胃癌细胞表型增殖、迁移、侵袭和凋亡。

启发学习

整体来看,本文逻辑缜密,步步为营,可以看做miRNA结合肿瘤探索机制类文章的模板文章,这类文章的思路在即将到来的国自然基金申请中可以充分利用。

首先利用前人文献提出假设,从发现主变量miR-590,到联系下游的VEGFR1/2,再通过上游转录因子探索找到Snail,最终再探究主变量miR-590对目的肿瘤表型的影响——通过调控VEGFR1/2而调控胃癌细胞表型增殖、迁移、侵袭和凋亡。

整体完整闭环,实验充分详尽,值得我们学习。

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