国自然三大热点:CRISPR、炎症小体及细胞焦亡的完美结合

胆汁淤积性肝损伤导致细胞死亡以及随后的炎症和纤维化。例如,导致原发性胆源性胆管炎(PBC)进展的不同细胞死亡途径之间的机制和回路尚未完全阐明。炎症小体及细胞焦亡均是近年来的热点,频繁登上顶刊,CRISPR技术更在近期斩获诺奖。在这篇Hepatology(IF=14.679)文章中,作者运用了CRISPR基因敲除技术,验证Nlrp3炎症小体介导的细胞焦亡在人和小鼠胆汁淤积过程中起着至关重要的作用,整体思路清晰,严谨细致。

 

1. 发现胆汁淤积性肝损伤激活人和小鼠中的炎症小体,胆汁淤积的严重程度与炎症小体激活增加有关

 

首先,作者从临床样本(PBC)及小鼠模型(BDL)入手,发现胆汁淤积的严重程度与炎症小体激活增加相关。如果有小伙伴已经拥有了足够多样本的临床生物标本库,那就恭喜您了,许多重要的临床科学问题就是从这里挖掘来的,也是高分文章的标配。

 

2. 急性BDL在Nlrp3-/-中引起更多的肝损伤和炎症

 

接着,作者构建了Nlrp3全敲模型,发现全敲小鼠并没有表型,于是进一步构建急性BDL模型,并有了惊喜发现,Nlrp3全敲可以加重肝损伤以及炎症。CRISPR技术荣获诺奖,但利用这个技术发表高分文章早已周知。除了老板有米,笔者觉得除了要有耐心(构建时间长),还得有足够的心理承受能力。笔者记得,隔壁实验室有位小伙伴好不容易繁育够量,庆幸可以做实验了,风风火火取材后却发现没表型,心情又跌到谷底。当然,总有解决的办法,比如这篇文章,作者进一步构建了疾病模型并发现到漂亮的表型。但假如有小伙伴发现表型跟预计的相反,怎么办?笔者也很想知道接下去该怎么办,多刷万事屋吧,嘿嘿!

 

3. Nlrp3敲除改变了细胞死亡的机制,导致急性BDL后凋亡和坏死性细胞死亡增加

作者在Nlrp3敲除的基础上进一步探讨机制。通过TUNEL染色定量阳性细胞、FAM-FLICA caspase-1检测、裂解的Caspase-3蛋白检测、RIP3免疫染色和免疫印迹、pMLKL染色并计数,发现Nlrp3敲除促进了急性BDL后凋亡和坏死性细胞死亡。

 

4. Nlrp3-/-小鼠在慢性胆汁淤积后肝损伤和炎症明显减少

 

分析了急性BDL后,作者又探索了慢性BDL小鼠的表型。发现跟Nlrp3-/-小鼠在慢性胆汁淤积后肝损伤和炎症明显减少,指标同Fig.2。

 

 

5. 慢性胆管结扎后,Nlrp3-/-小鼠的总细胞死亡得到改善,WT仍然表现出细胞焦亡

 

同样的,作者对慢性模型也进行机制的分析。发现慢性胆管结扎后,Nlrp3-/-小鼠的总细胞死亡得到改善,但是,野生型仍然表现出细胞焦亡。方法同Fig.3。

 

6. WT小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤后出现明显桥接纤维化

 

此外,作者发现BDL后28天在WT中观察到桥接纤维化,但是在NLRP3全敲小鼠中未观察到。检测指标包括Sirius Red染色及量化、纤维化相关基因表达、aSMA染色及量化、aSMA蛋白表达。

 

7. 急性和慢性胆管结扎后,Nlrp3缺失可显着减轻肾脏损伤和纤维化

 

相反,作者还发现NLRP3敲除抑制了急性和慢性BDL后的肾脏损伤和纤维化。指标包括:H&E,NGAL,Ly6G和PAS染色及定量、肾脏损伤基因的表达、F4/80染色及定量、Col III染色及定量。

 

8. MCC950干预可保护WT小鼠免于慢性BDL诱导的肝损伤

 

最后,作者做了治疗实验。指标同前面的表型指标类似,结果发现MCC950干预可保护WT小鼠免于慢性BDL诱导的肝损伤。

 

结论:胆汁淤积性肝损伤可导致胆梗塞和炎症,通过三种不同的机制导致细胞死亡。在野生型中主要涉及细胞焦亡和程序性坏死,而在Nlrp3-/-小鼠中主要涉及程序性坏死和凋亡。与敲除小鼠相比,WT小鼠的炎症更持久。另外,Nlrp3-/-小鼠中更强的初始炎症反应导致卵圆形细胞活化。MCC950作用于细胞焦亡途径,可导致不太严重的炎症反应和随后的纤维化。

 

研究路线

 

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