m6A在肿瘤中的研究思路

乳腺癌是最常见的转移到大脑的原发肿瘤类型,30%的乳腺癌患者发生脑转移存活率极低。N6-甲基腺苷(m6A)是最丰富的内部RNA修饰形式。m6A-RNA修饰在多种细胞功能中有调节作用。识别、写入或擦除m6A的蛋白质的改变可以导致括癌症在内的病理条件。今天小编带来的就是一篇m6A修饰在乳腺癌脑转移中的研究,这篇文章是2020年发表在Cancer Cell(IF=26.6)上,让我们一起来看一下这篇文章的主要研究思路吧。

 

1. YTHDF3在乳腺癌脑转移中的表达增加,并与无转移患者生存期降低直接相关。

 

作者首先利用公共数据库中发现YTHDF3在乳腺癌脑转移组织中明显高于乳腺原发肿瘤。通过分析TCGA乳腺癌数据集发现乳腺癌患者总体存活率低与YTHDF3高表达直接相关,临床病例验证。

结论:表明YTHDF3表达增加与乳腺癌脑转移和低存活率有直接关系。

 

2.YTHDF3缺失对小鼠脑转移瘤形成和生存的影响

 

为了研究YTHDF3在脑转移中的作用,作者构建了YTHDF3敲降细胞系。在免疫耐受模型和异种移植模型中,敲降显著抑制了这些细胞的脑转移,并且延长了脑转移小鼠的总体存活时间。小动物成像表明敲降后可抑制细胞的脑定植和脑转移。将对照和敲降细胞原位注射到小鼠的乳房脂肪垫中,发现敲降细胞不影响肿瘤生长。

结论:HDF3在乳腺癌细胞脑转移形成过程中起关键作用,且缺失并不影响原代肿瘤生长。

 

3.YTHDF3促进乳腺癌细胞脑内皮细胞黏附、渗出,侵袭和与星形胶质细胞的相互作用

 

在研究YTHDF3对肿瘤转移影响时,YTHDF3敲降后肿瘤细胞的脑定位明显降低,并且降低了它们与人脑微血管内皮细胞的粘附性。作者发现敲降肿瘤细胞渗出明显减少,并且侵袭能力降低。通过血脑屏障(BBB)体外模型发现抑制了敲降细胞跨BBB转运。敲降细胞与星形胶质细胞单层的黏附降低,转移瘤减少并且血管密度明显降低,脑内皮管形成也明显减少。

结论:YTHDF3通过影响多个脑转移步骤,包括脑内皮细胞粘附、外渗、侵袭、癌细胞-星形胶质细胞相互作用和血管生成,促进乳腺癌脑转移。

 

4.高通量反相蛋白质芯片、RIP-Seq和m6A甲基组图谱鉴定YTHDF3靶点

 

接下来作者研究YTHDF3在脑转移中作用的分子机制,首先利用基因芯片发现差异表达蛋白。之后进行了RNA免疫沉淀测序(RIPseq),发现与YTHDF3蛋白结合的直接靶点。交联免疫沉淀(CLIP)实验证实了五个转移相关基因的转录本的直接结合。作者又通过转录图谱和q-PCR发现YTHDF3对这些基因的调控不是在mRNA水平上进行的。真核细胞翻译起始因子EIF3a显示,YTHDF3敲降降低了eIF3a与五个转录本的结合并且多聚体反应显著减少。这些结果表明YTHDF3对这些脑转移基因的翻译有影响。

 

5.ST6GALNAC5、GJA1、EGFR和VEGFA是YTHDF3在乳腺癌脑转移中的功能必需靶点

 

随后作者构建了YTHDF3过表细胞系,过表后这些细胞体外侵袭力和血管生成和脑转移能力显著增加。体内BLI显示,YTHDF3过表细胞在心内注射后其脑组织中肿瘤细胞的定位显著增加,促进了血脑屏障迁移和脑外渗。过表细胞体外跨血脑屏障迁移增加,敲除ST6GALNAC5或GJA1可以显著降低了这种增加。EGFR或VEGFA的敲除抑制了过表细胞的血管生成能力。

结论:YTHDF3在促进乳腺癌脑转移中具有重要作用并且ST6GALNAC5、GJA1、EGFR和VEGFA是YTHDF3在脑转移中的重要功能靶点。

 

6.YTHDF3对脑转移关键基因表达的调控依赖于YTHDF3与m6A修饰的mRNA的结合

 

YTHDF3中有m6A的RNA特异性结合区域。因此,作者通过m6A测序(m6A-seq)定位了肿瘤细胞的m6A甲基组。五个靶基因都在m6A峰中有富集。作者在构建了YTHDF3突变细胞,结果发现突变降低了YTHDF3与靶基因转录本的结合。在突变细胞中,靶基因的多聚体比例显著减少,同时,突变细胞降低了的侵袭和脑转移能力。

结论:YTHDF3在促进关键的脑转移转录本翻译方面的功能,并且这一过程依赖于YTHDF3与m6A修饰的mRNA的结合。

 

7. YTHDF3通过与自身5’UTR内的m6A残基结合,自动调节其翻译

 

作者通过RIP-seq和Clip-qPCR数据中,发现YTHDF3蛋白与自己的mRNA相互作用。在细胞中过表达Flag-YTHDF3可增加YTHDF3蛋白水平,但不调节mRNA水平。M6A-seq检测到YTHDF3mRNA有m6A峰。此外,CLIP-qPCR分析表明, 5’UTR区与YTHDF3蛋白的结合最强。YTHDF3也显著促进eIF3a与YTHDF3 mRNA的结合。接下来,作者发现5’UTR-YTHDF3 GFP报告活性随野生型YTHDF3蛋白的表达而显著增加,但在m6A结合突变的细胞中没有上调。

结论:YTHDF3通过与50UTR内的m6A残基结合,自动调节自己mRNA的翻译。

 

 

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