文献解读:乳腺癌小RNA预后

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Bioinformatic Identification of miR-622 Key Target Genes and Experimental Validation of the miR-622-RNF8 Axis in Breast Cancer
生物信息+实验验证:乳腺癌中的miR-622靶基因

 

Hello,大家好啊,今天小编想和大家分享的是一篇发表在Frontiers in Oncology的关于miRNA靶点识别的文章。文章思路简单,易于模仿。首先基于生物信息分析识别出miRNA的靶点基因,对这些靶点基因进行简单的分析注释以及互作网络构建,挖掘出一些较为关键的miRNA靶向过程。另外,文章在生物信息分析的基础上加入实验验证,以证明结果的可靠性以及可重复性。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近几十年来,已经有许多研究表明miRNAs(转录后水平调控基因表达的短非编码RNA)参与了多种与肿瘤发生、进展和转移相关的hub基因调控。然而,关于miRNAs调控乳腺癌转移的确切机制仍然不够明确,对新靶点的识别造成一定的限制。因此,本篇文章旨在研究mir -622相关的癌症主要调控机制。首先,文章发现miR-622与各种癌症的不良预后显著相关。通过miRNA预测过程的整合,作者识别出77个潜在靶点,并对蛋白-蛋白相互作用网络进行构建。接着通过GO和KEGG pathway分析,确定miR-622及其调控网络的潜在功能。然后,在蛋白质-蛋白质相互作用网络中确定一个由六个中心基因组成的关键簇。这些基因被进一步选择用于TCGAGEO数据集的泛癌表达、预后和预测标记分析,以挖掘这些hub基因的潜在临床价值。为进一步验证我们的生物信息学结果,miR-622和RNF8(被认为是促进乳腺癌细胞EMT过程和乳腺癌转移的中心基因之一)的靶向关系被纳入体外实验验证。体外实验证实miR-622对RNF8的直接调控,并发现预测的miR-622-RNF8轴可以调节RNF8诱导的上皮-间质转化、细胞迁移和细胞活力。这些结果在挽救实验(rescue experiments)中得到进一步的验证。总之,这篇文章不仅基于生物信息分析识别出miR-622的hub靶基因,还首次在体外揭示了miR-622在乳腺癌细胞EMT过程、生存能力和迁移中的调控机制。文章的工作流程如图1所示。
Fig1.文章的工作流程

 

一、 miR-622靶点及其预后价值探索
为了评估miR-622在多种癌型中的预后价值,我们基于pan-cancer TCGA miRNA 数据库进行miR-622的pan-cancer生存分析。结果表明,患者生存率与mir – 622高丰度在乳腺癌,宫颈鳞状细胞癌等癌型中呈负相关;在食管腺癌等癌型中预后与miR-622丰度不相关;在膀胱癌等癌型中, mir – 622高丰度与预后呈正相关。泛癌分析的生存结果表明,miR-622在不同的癌型中扮演着不同的角色,可能是许多癌症的预后标志物,尤其是在BC、OV和LIHC等癌型中。
本篇文章还分析了METABRIC数据库中乳腺癌患者miR-622与存活率之间的关系。研究者发现,不管是在METABRIC(图2A),还是在TCGA(图2B)数据集中,高miR-622丰度均与不良预后显著相关。总之,这些分析表明,miR-622可能是乳腺癌患者预后的潜在标志物。
图2. miR-622高,低表达的生存分析。

 

为了了解miR-622如何参与不同的生物学过程,基于5种较为可靠的miRNA靶点预测工具预测miR-622的潜在靶点。对5种预测目标基因集交叠结果进行整合和可视化(图3)。最后,5个工具预测出包括YPEL2、RNF8和RB1在内的77个重叠基因(图3),这些基因被认为是miR-622的潜在靶点,参与miR-622调控的生物学过程。
 
图3.多种工具预测的miR-622潜在靶点以及miR-622-靶点相互作用网络。

 

二、 预测靶点基因的生物信息学分析
1. GO节点注释和KEGG富集分析
为了在细胞水平上更好地了解miR-622的功能和调控模式,使用基于web的功能富集工具Metascape和KOBAS对miR-622的77个重叠靶基因进行GO(p<0.01)注释和KEGG(p<0.05)通路富集分析,富集分析结果如(图4所示)。
图4. miR-622预测靶点基因的GO注释和KEGG通路富集分析。

 

2. PPI互作网络的构建
基于String数据库构建这77个重叠基因的蛋白-蛋白相互作用网络,如图5A所示。25个至少与另一个基因存在互作关系的基因被选为hub基因。这25个基因中,有3个基因在侵袭性乳腺癌(BRCA)与正常样本中发生差异表达。因此,这3个靶点基因与miR-622形成的靶向关系可能参与BRCA疾病进程。基于MCODE挖掘网络中潜在的相互连接区域,最终挖掘到一个包含6个节点和8条边的互作网络 (图5B)。这些基因可能是参与miR-622调控的生物学过程的关键基因,可以进一步被筛选并可以用于进行实验验证。
图5. 77个基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。

 

3. hub基因的泛癌表达分析
为了了解这25个hub基因在各种癌症中的作用,对TCGA数据库中这些hub基因在癌症和正常组织中的表达模式进行分析。这些hub基因在不同癌症中表有不同的表达模式。在THYM中RNF8,在LAML中YPEL2,在DLBC中E2F6均具有高度差异表达,提示该基因与相应的肿瘤具有很强的相关性。

 

4. hub基因的预后潜力
通过Kaplan-Meier曲线和GEPIA测定PPI网络中选择的25个乳腺癌hub基因的预后值,以判断这些hub基因是否可以作为预后标志物。结果表明,在BRCA患者中, RGS4,DYRK2等基因的高表达均与患者生存负相关(图6),YPEL2 TLK21等基因的高表达均与患者生存呈正相关(图6)。这些基因可作为乳腺癌的潜在预后标志物。
图6 . hub靶点基因高,低表达的生存分析。

 

5. hub基因的预测价值
ROC曲线结果表明,HIST2B、DYRK2和RB1可作为乳腺癌的预测标志物。

 

三、 miR-622-RNF8靶向过程的验证
1. miR-622通过直接靶向RNF8的 3 -UTR来抑制RNF8的表达
最近的两篇文章报道RNF8是乳腺癌细胞EMT过程中的关键分子。我们推测miR-622可能通过RNF8的直接调控来调控EMT过程。此外,miR-622与乳腺癌之间的关系尚未被研究,因此,我们选择miR- 622-RNF8轴作为miR-622的生物信息学靶点分析的体外实验验证。
为了验证miR-622在体外对RNF8的调控实验中,我们发现miR-622可以直接靶向RNF8 的3 – UTR并调控上游荧光素酶的表达。为进一步支持miR-622在体外抑制RNF8表达的假设,在一个高表达RNF8的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,分别转染miR-622 激动剂和抑制剂。结果显示,转染miR-622 激动剂时,MDA-MB-231细胞中miR-622丰度大幅上调(图7E), RNF8蛋白水平显著下调(图7F,G)。因此,miR-622被认为可以直接调控乳腺癌细胞中的RNF8,验证miR- 622-RNF8的靶向关系。
图7 .miR-622抑制RNF8表达。

 

2. miR-622抑制乳腺癌细胞上皮间质转化,影响乳腺癌细胞的生存能力和迁移能力
由于RNF8可以诱导乳腺癌的EMT过程,而miR-622可以直接调控RNF8的表达,我们推测miR-622可以通过调控RNF8来调控EMT过程。通过分别上调和下调实验中miR-622表达发现,过表达的miR-622可下调RNF8和间质细胞标志的表达,表明miR-622抑制了乳腺癌细胞的EMT过程。此外, miR-622的下调可上调RNF8的表达以及间质状态标记物的表达(图8A),而上皮状态标记物的表达显著降低(图8A)。
为探讨miR-622对乳腺癌细胞迁移和生存潜能的影响,我们通过转染miR-622 激动剂使miR-622在MDA-MB-231细胞中过表达进行CCK8细胞存活率(图8B,C)、迁移实验 (图8D,E)和伤口愈合试验(图8F,G)测定。miR-622的降低促进乳腺癌细胞的生存能力(图8B)和迁移能力(图8D,F)。
图8.miR-622通过RNF8抑制乳腺癌细胞EMT、细胞活力和迁移。

 

3. 乳腺癌细胞MCF7的拯救实验表明,mirR-622介导的迁移和EMT依赖于RNF8
在miR-622 抑制剂处理组中,RNF8和snail的蛋白水平显著升高(图9B),细胞迁移数量显著增加。进一步将miR-622抑制剂和RNF8靶向siRNA共转染细胞,在siRNA介导的RNF8下调之后,snail的表达和细胞迁移发生部分逆转(图9B,C,D)。这些结果表明miR-622可以通过直接调控RNF8表达来调控EMT及其相关的功能表型。
图9.拯救实验显示RNF8是miR-622在
EMT和乳腺癌细胞迁移中的直接功能靶点。

 

好了,今天的文章大概内容就是这些,让我们来总结一下吧。首先,文章基于生物信息学分析识别出miR-622的潜在77个靶点,对这77个靶点进行通路注释,富集分析以及蛋白质互作网络构建;接着,基于MCODE挖掘出互作网络中高度连通的子网络以及hub基因,结合最近的实验报道,筛选出miR-622-RNF8的靶向关系,并将其纳入实验验证。实验结果表明miR-622-RNF8在乳腺癌生存能力和迁移中的关键调控机制。

 

这篇文章是一篇很传统的生物信息分析+实验验证结合的文章,经费多多的同学可以考虑模仿下,囊中羞涩的小伙伴儿就还是好好钻研下生信分析吧。今天的内容到这里就结束了,我们下期再见!

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