原代神经元细胞培养方法与技巧

各位未来的神经科学家们,相信你们海马和皮层在认知、学习和记忆中的作用已经听到耳朵长虫子了吧!今天我就来带你体验一下分离原代神经元的精(jing)彩(xian)过程。
!!!Before

1、Poly-d-lysine包被细胞培养板,一般是放在细胞培养箱中,至少包被2h,如果时间充裕,建议过夜。记得用前用DPBS或者双蒸水洗1-3遍,一定要洗,不洗神经元宝宝活不长的。别问我是怎么知道的

2、准备好足够的冰块~~取着取着冰块不够用的都是小猪猪哦

3、记得在做之前准备好下表中的medium。

Trypsin,DNase,STBI这三种试剂也是需要的,一般都是用的sigma(没有广告费啊)的,货期有点小长,记得提前准备啊。上表中的HBSS如果嫌麻烦,就用DPBS,这个亲测无数次,没得问题。

Action

1,选取P24h之内的新生鼠,置于75%乙醇中浸泡消毒。每次小编在对这些可爱的白内透粉的鼠宝宝之前都会拜一拜各路神仙,O(∩_∩)O。

2,快速分离鼠宝的body and head,默念三声sorry~~~置于遇冷的buffer中。不要问我放多少,不要太小气,但是一定要没(mo)过!!!

———-分割线  以下操作在无菌操作台进行,也要在冰上进行

3,此时请移步☞无菌操作台,此时此刻,应该拿出你最快的速度最帅的姿势,迅速用眼科镊取剥开鼠宝宝还没有发育成骨的脑壳儿,得到示意图那样的脑子。

4,按照示意图指示继续往下做,其实吧,告诉你也无妨,分离脑膜的秘密就是抓住一个口,沿着这个小口,轻轻的撕,不要弄碎,然后就能撕下完整的一块儿。此处不需要体式显微镜的加持…至于海马脑膜怎么快速的取下,可以下方留言告诉你哈。

5,分离完毕脑膜之后,那就准备用手术刀或者弹簧✂来分离白白净净的鼠脑,剪(duo)成1mm大小的正方体之后,用1毫升枪尖吹打成糊状。此时,你的脖子和眼睛都能解放了。

6,加入适量typsin,一般一只小鼠的皮层一毫升,海马半毫升。37度水浴15-20分钟,不要超过20分钟哦。一般我会在10分钟的时候拿起来摇一摇看一看,液体的状态,比如,看起来黏不,透明不?

7,加DNase,轻轻混匀后,室温静置5分钟。然后离心。

8,用platingmedium以每平方毫米65个细胞的密度铺板,孵育2-6hrs后更换培养基为neurobasal-B27 maintenance medium(NBmedium)。番外:之前在帖子上看到说,原代神经元最适合在六孔板中生活,详见某乎。

接着,可以选加阿糖胞苷,没错就是那个很常见也很伤肝儿的化疗药。我做过对比,加不加对神经元的比例影响不是很大,但对细胞的生死影响不小。

但如果你的鼠宝已经不再粉嘟嘟的时候,还是要酌情考虑的。一般来说,养个一个月的没有问题,7天是成熟的时候,当然5-6天的也有人用。养太久的话,记得两周半量换液一次哈。

参考文献:culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.

基础实验

收到细胞后应当于ATCC官网的金标准进行比对

2019-11-25 21:23:48

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2019-11-26 21:42:48

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