如何保护脆弱的短链RNA 避免RNA降解

一入科研路,一把辛酸泪。

课题组里有2-3个同学做短链RNA修饰,很不幸,我就是其中之一。

刚进实验室就听说RNA非常不稳定,脆弱的像博士生的头发,一不留神就“断了”。

与DNA相比,合成RNA的过程耗时长、步骤繁琐。同时进组的同学已经合成完修饰DNA的亚磷酰胺单体,我还在保护修饰RNA的2′-羟基;同一天固相合成,师姐已经在表征DNA的性质,我还在等待2′-羟基保护基的24小时脱除。

这不是重点,重点是DNA像坚固的城墙,基本可以抵御风雨的侵蚀;而RNA是战后的断壁残垣,稍有风吹雨打则崩坏坍塌。

 

 

年初,课题还没有完结的我需要制备大量的修饰RNA样品。

历时一周,来回合成了三拨样品。不分昼夜,周末加班。

就在我把其中一半样品混合,进行离心浓缩的时候。刚开始做核酸领域课题的小师姐制备长链DNA ladder,把含有1M哌啶的DNA样品放进了离心浓缩仪跟我的RNA共旋。

两个小时之后,我才知情。

样品残,满管伤,我的RNA已泛黄。

后续的质谱显示RNA已全部裂解。

心情崩溃。但是无可奈何。

想起了之前我跟不稳定RNA的缘分。

 

 

2017年年末,一次gel实验发现,固相合成后十几个核苷长度的天然RNA在pH 7.0缓冲液中、37℃孵育的体系中24小时发生大量裂解,产生了序列特异性的gel条带。

这是不正常的。

虽说RNA不稳定,但如此温和的体系中它们应该“守身如玉”,不会产生裂解。

我忧心忡忡地跟师兄讨论。

“会不会是某种酶,特异性地切割某些特定位点。”师兄也一阵头大,“这种情况之前从没有遇到过。”

之后,我重新用DEPC水处理了枪头、离心管等耗材,配置了RNA洗脱液等试剂。

然并卵。

陆陆续续地想了许多办法,但RNA降解如决堤的洪水,一发不可收拾。

隔壁组师兄教我用乙醇沉淀的方法将RNA从洗脱液中提纯。Gel图显示,这次降解的量明显减少。

将情况告诉老板,老板发给我用正丁醇沉淀纯化RNA的步骤。“正丁醇可以沉淀短至7个核苷长度的RNA,我做过。”

我……

要知道,用固相合成仪合成完的RNA样品要经历诸多磨难:首先用胺将其从固相载体上切除下来,离心浓缩至干;加入氟离子试剂,24小时脱除硅基保护基;脱盐柱脱盐并浓缩;gel纯化切下紫外条带,洗脱液洗脱下RNA样品,再经脱盐柱脱盐并浓缩。

额外加正丁醇沉淀的步骤,岂不是产生额外损失。

“但为了样品稳定,还是要试一下的。”

一番实验后,gel胶中显示样品没有裂解。

致此,耗时4个月的RNA稳定性大战终于结束了。

嗯,虽然没有明确的证据表明敌人是谁,但总归是将其除去了。

我们推测可能的原因,C18脱盐柱效果较差,RNA样品中盐浓度太高。RNA发生了酯交换反应;嘌呤与嘧啶之间磷酸二酯键更容易断裂,因此裂解呈现出序列特异性。

 

短链RNA容易发生裂解,根源在于RNA含有的活泼羟基,容易被金属离子、普通碱、蛋白质中的碱性侧链基团活化,催化磷酸二酯键短链。处理过程中需要小心谨慎。避免RNA暴露在上述体系中。

科研路不易,且行且珍惜。

RNA一降解,实验两行泪。

可能是个例,但还是要祝愿所有小伙伴,样品都稳定。

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