分离单个核细胞的常规方法及技巧

背景

从2019年3月起,我开始采用淋巴细胞分离液(Ficoll液)分离外周血中单个核细胞进行免疫学方面实验,因为实验所需单个核细胞量较大,所以单个核细胞分离的得率成为决定实验成功与否的一个关键因素。而我在单个核细胞分离方面从一开始的得率不高到现在的相对稳定,这其中也经历了不少的摸索和分析。

困惑

每毫升外周血中理论上有10^6个单个核细胞,而我们在实验室中采用淋巴细胞分离液(Ficoll液),分离200ml外周血初分白细胞,最初只能得到(6-7)×10^7个单个核细胞,远低于理论值2×10^8,到底是何原因呢?是我们的操作不规范,还是实验器材及试剂的选择存在问题?因此,我们在一次次的分离中不断地摸索、改进,尽可能地提高外周血单个核细胞的分离得率。

探索

分离单个核细胞的常规方法如下:在离心管中加入适量淋巴细胞分离液,去肝素抗凝静脉血与等量Hank液或PBS充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于Ficoll液液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。离心后管内分为3层,上层为血浆和Hank液,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。用玻璃吸管插到云雾层,吸取单个核细胞置入另一离心管中,加入5倍以上体积的Hank液或PBS,1000rpm×8分钟,洗涤细胞3次。即得到单个核细胞。

刚开始我认为只要按照此操作流程进行,成功分离单个核细胞应该没问题,但是几次实验下来,我发现单个核细胞的得率不高,通过不断的摸索以及与老师的讨论,发现很多影响单个核细胞分离的问题,概括起来有以下几点:

1. 分离单个核细胞所选用的离心管在我们实验室里有两种离心管(玻璃的和塑料的)可用于分离外周血单个核细胞,一开始我采用塑料管进行分离,但是分离效果不好,主要表现为离心之后所形成的单个核细胞白膜层分界不清楚,因此吸取白膜层时不容易辨别,而且白膜层容易贴在管壁上,损失较大。后来我们改用玻璃离心管,离心之后白膜层分界较为明显,容易辨别,细胞损失随之减少。

2. 外周血的稀释问题实验中所采用的抗凝外周血一般要经过稀释,常用的稀释液一般为PBS或Hank液。在我的实验中所采用的外周血来源于直接抽取的外周全血,或购自血液中心的经过初分的外周血白细胞。通常情况下,外周血与稀释液的混合比例为1:1~1:1.5为宜,如稀释液加得过少,外周血稀释不完全,当加到Ficoll液面上后,容易往下沉;稀释液加得过多,外周血过于稀释,当加到Ficoll液面离心后所得到的白膜层较薄。个人经验觉得如果采用外周血初分白细胞进行实验时,与稀释液的混合比以1:1为宜,而采用抗凝外周全血进行试验,与Hank液混合比以1:1.5为宜。

3. 加样问题加样是最重要的步骤,先加5mlFicoll液,再缓慢地沿管壁加入稀释后的全血,开始加样时一定要缓慢,待形成液层后才能加快些,切记不要快速用力加样,这是实验成功的关键。

4. 离心问题这一步看似简单,却是影响分离效果的一个关键步骤。

首先,离心之前要将离心管精准配平,否则容易造成离心不完全导致中间白膜层不集中。一开始我对离心配平的概念不是很清楚,觉得只要套筒内的离心管个数相等重量就应该差不多,离心时不会出现太大问题,但是经过几次分离之后,发现离心之后白膜层出现往下飘散的情况,后来经过老师的提醒,采用天平对每对装有离心管的转子进行精准配平,离心后效果明显改善;

其次,离心时间,一般是2000rp×20分钟,离心过程中要注意缓升缓降,即离心启动时的加速时间和停止时的降速时间要尽量的长,以保证离心后的白膜层较为集中,然而现在很多离心机虽然设置了升降速时间,但在实际过程中根本达不到预订效果,升速和降速过程中离心机晃动的比较厉害,导致分离后的白膜层飘散的比较厉害;

此外,离心所选用的套筒也很重要,我之前所用的是一台旧离心机,离心机内配的是橡胶套筒,后来换了一台新离心机,配套的是塑料套筒,本以为新离心机效果会更好,但是几次分离下来,感觉离心效果不是很好,白膜层还是飘散厉害,后来我用旧离心机和新离心机同时离心同一批样本,发现旧离心机离心效果较好,个人经验觉得套筒应选用橡胶制的较好,这样对离心管有一个缓冲保护作用,不至于对离心管产生较大晃动,分离效果会较好。

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