Western blot实验中常见的失败现象及解决方案

俗话说得好,Western blot做不好,毕业毕不了!
 
想必每个初入实验室的的小伙伴都要掌握,然而作为科研研究中最为平常的实验,却常常能把人虐得体无完肤!下面就跟大家来分享一下实验过程中会出现哪些现象,是什么原因,如何来解决。
 

1. 出现黑点或黑斑

原因:试剂污染,抗体结合到封闭剂

解决方法:使用新鲜配置的试剂;过滤封闭液;选用其他类型封闭液

2. 条带中出现边缘规则的白圈

原因:转膜时膜和胶中间有气泡,或抗体在膜上未均匀分散

解决方法:制备转膜凝胶时用玻棒赶去气泡;使用摇床孵育抗体

3. 条带拖尾

原因:样品有未溶颗粒;分离胶浓度偏大

解决方法:充分溶解,加样前离心;换小浓度分离胶

4. 条带扭曲,如微笑带

原因:胶未配好(凝胶未能完全聚合,胶中有颗粒或气泡,凝胶未冷却好,);电压过高;

解决方法:正确添加质量合格且未过期的 AP 及 TEMED;过滤配胶的试剂保证配胶过程中胶内无气泡;凝胶冷却好后再上样;降低电压

5. 出现非均一性背景

原因:膜可能曾经干过

解决方法:在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态

6. 条带中间出现白色(反白)

原因:中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快,中间部位底物消耗完后无法发光

解决方法:降低蛋白量,降低一抗与二抗的浓度

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