以ACE2为受体挖掘治疗新型冠状病毒肺炎潜在中药及单体成分

摘 要:目的  以血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)为受体探讨中药及单体治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的作用机制。方法 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索作用于ACE2受体的中药及单体。通过UniProt、GeneCards等数据库查询中药单体作用靶点对应的基因名,进而运用Cytoscape3.2.1构建化合物-靶点(基因)网络,通过DAVID进行基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,预测其作用机制。结果  葛根素-靶点网络中靶点54个,关键靶点涉及AKT1、VEGFA、TNF等。GO功能富集分析得到GO条目554个(P<0.05),其中生物过程(BP)条目486个,细胞组成(CC)条目26个,分子功能(MF)条目42个。KEGG通路富集筛选得到162条信号通路(P<0.05),涉及小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肾素-血管紧张素系统通路等。分子对接结果显示葛根素与ACE2和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的亲和力与推荐用药相近。结论  葛根素与ACE2结合作用于AGTR1、NOS3、HIF1A等靶点调节多条信号通路,从而有可能对COVID-19有治疗作用。

201912月湖北省武汉市爆发的新型冠状病毒肺炎疫情吸引了全球有关科研人员的高度关注。2020211日,国际病毒分类委员会(ICTV)宣布,将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2SARS-CoV-2,曾用名为2019-nCoV),这表明SARS-CoV-2从分类学角度上讲,是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的近亲。而世界卫生组织(WHO)同日宣布,由这一病毒导致的疾病正式命名为2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。文献报道[1-2]SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV,非典)两种病毒感染细胞的途径均通过其表达的S-蛋白与人体内血管紧张素转换酶IIACE2)的结合,导致病毒侵入机体而致病。此前,基因测序等研究结果显示[3],新出现的这种冠状病毒与SARS-CoV同属冠状病毒科的β属冠状病毒。美国国家过敏与传染病研究所(NIAID)表示,从显微镜图像来看,SARS-CoV-2与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和2003年的SARS-CoV看起来并无太大不同。

严重急性呼吸综合征(SARS)的发病机制是由SARS-CoV上的S蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合,而ACE2SARS-CoV S蛋白的功能性受体[4-6]2013Nature报道[7]SARS-CoV感染的一般过程是:SARS-CoV的刺突蛋白三聚体先与ACE2的细胞外催化结构域的“疏水口袋”结合,继而细胞发挥内吞作用,病毒包膜与细胞膜融合,最终进入宿主细胞。有学者在感染了SARS-CoV的细胞中分离出肾素(REN)和血管紧张素IIAng II),它们可以和SARS-CoV的刺突蛋白高效结合,且细胞ACE2的表达量与SARS-CoVS蛋白的易感性正相关,宿主细胞转染ACE2后,病毒的复制能力增加[8]。实验发现[9]SARS-CoV感染的小鼠ACE2表达下调,而ACE的表达没有明显改变,提示SARS-CoV也许就是通过ACE2路径导致肺功能损伤。最新研究发现[10]ACE2SARS-CoV-2的亲和力是SARS-CoV1020倍,ACE2SARS-CoV病理途径中的关键因子,在临床的治疗及药物的研发中有着重要的意义。ACE2主要分布在心脏、肾脏、睾丸、大动脉、胃肠道、视网膜、肺,在人和啮齿类动物的心脏和肾脏中高度表达[11]结构见图1

到目前为止还没有针对SARS-CoV-2的上市特效药,一些抗病毒药物和中药已用于临床治疗COVID-19,但疗效并不确切。因此,根据冠状病毒结构针对SARS-CoV-2感染过程的关键靶蛋白ACE2进行中药及其单体化合物的筛选,通过网络药理学筛选出化合物作用靶点进行聚类分析,进而运用分析软件对化合物靶点进行分子对接以及代谢通路分析等,为后期的深入研究以及新药开发提供参考。

1  方法

1.1  中药及单体成分收集

借助中药系统药理学分析平台[12]TCMSPhttp://tcmspw.com/),以“Angiotensin-converting enzyme 2”为关键词检索作用于ACE2的中药及单体化合物。

1.2  作用靶点的获取

TCMSP,以“葛根素(puerarin)”为关键词检索葛根素中的作用靶点并采用反向药效团匹配的方法将葛根素以*.mol2格式上传到PharmMapperhttp://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/网站[13],将靶点种类设定为Human Protein Targets Onlyv20102241),其他参数均为默认设置。

1.3  靶点网络的构建

STRING数据库[14]https://string-db.org/,版本:11.0)是一个在线搜索已知的蛋白互作关系的数据库,目前已经更新到11.0版本,共存储了2 031个物种,9 643 763种蛋白,1380 838 440个相互作用的信息。运用STRING数据库分析葛根素作用靶点之间关系进而使用Cytoscape软件[15]http://www.cytoscape. org/,版本:3.6.1)进行可视化分析,通过度(degree)值大小设置PPI网络中蛋白质关系强弱。

1.4  通路和GO分析

为了进一步了解上述筛选出的核心靶点的功能以及在信号通路中的作用,将筛选得到的葛根素作用靶点导入DAVID数据库[16]https://david. ncifcrf.gov/home.jsp,版本:6.7),通过输入靶基因名称列表并限定物种为人,将所有靶基因名称校正为其官方名称(official gene symbol),经上述数据库检索和转化操作,设定阈值P0.05,进行GOgene ontology)生物学过程富集分析和KEGGKyoto encyclopedia of genes andgenomes)信号通路富集分析,并用在线绘图网站Omishare Toolshttp://www.omicshare.com/tools/index.php/)将其结果以高级气泡图的形式呈现。

1.5  成分靶点分子对接

ChemOffice软件构建葛根素3D结构保存为*mol2格式并使其能量最小化。根据网络药理学筛选结果,从PDB数据[17]https://www.rcsb.org/)下载ACE2PDB ID1R42)蛋白质3D结构*PDB格式,SARS-CoV-2是由上海科技大学饶子和/杨海涛课题组测定的SARS-CoV-2 3CL水解酶(Mpro)高分辨率(PDB ID6LU7)晶体结构。运用PyMOL软件对蛋白质进行去水、加氢等操作,利用Auto Dock软件将葛根素及靶蛋白格式转换为*pdbqt格式,最后运行Vina进行对接。

2  结果

2.1  中药及单体化合物的发现

通过TCMSP数据库搜索作用于ACE2受体的中药以及单体化合物,发现葛根素是作用于ACE2的中药单体化合物,中药柴胡、川牛膝、葛花、萱草根和葛根中含有葛根素,基本信息见表1

2.2  葛根素潜在靶点信息

通过TCMSP数据库以及PharmMapper网站查找已报道的靶点最终得到葛根素的潜在靶点共54个,将靶点名称上传到UniProt数据库(http://www.uniprot.org/),并限定物种为“Homo sapiens”,校正靶点名称为“Official gene symbol”,由此获取与葛根素相关的靶点信息,结果得到相关靶点54个。

2.3  葛根素作用靶点网络分析

将查询得到的54个靶点带入STRING数据库通过Cytoscape软件中可视化,见图2。葛根素作用靶点的蛋白互作网络的拓扑学分析,见表2(度值≥30)。经Network Analyzer分析网络拓扑学属性发现,蛋白互作网络包含54个节点,467条边,其中节点表示蛋白,每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系,靶点越大表示关联度越强,其中平均节点度为17.30

2.4  葛根素作用靶点的生物信息学分析

DAVIDGO功能富集分析得到GO条目554个(P0.05),其中生物过程(BP)条目486个,细胞组成(CC)条目26个,分子功能(MF)条目42个,分别占88%5%7%,见图3

KEGG通路富集筛选得到162条信号通路(P0.05),涉及小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肾素血管紧张素系统通路等,其中小细胞肺癌通路涉及AKT1-CDKN1B-PTGS2-CASP9-ELA-BCL2-NFKBIA-NOS2;非小细胞肺癌通路涉及PRKCA-AKT1-CASP9-BAD;肾素血管紧张素系统通路涉及ACE2-AGTR1,见图4

2.5  葛根素与ACE2SARS-CoV-2 3CL水解酶的分子对接结果分析

葛根素作用于2个靶蛋白的对接结果见表3一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低,发生的作用可能性越大[18]。分子对接结果显示葛根素与2个靶蛋白的分子对接结合能均远远小于−20kJ/mol,由此表明葛根素与2个靶蛋白均有较好的结合活性,分子对接模式图见图5

3  讨论

葛根素亦称葛根黄素,主要是从中药葛根中分离的异黄酮类衍生物。葛根素具有多种药理活性,包括对心血管、脑部、肝脏损伤的保护作用,抗肿瘤以及治疗糖尿病等[19]。最新研究发现[20-21],葛根素对人炎性因子肿瘤坏死因子TNF-α)诱导的小细胞肺癌细胞迁移和侵袭具有促进作用;高剂量葛根素升高肾脏组织中血管紧张素I型受体(AT1)和ACE2 mRNA表达,而低剂量葛根素可降低心肌中AT1ACE2 mRNA表达,AT1ACE2之间可能存在正反馈调节机制。中医普遍认为COVID-19是由于湿毒犯肺所引发的,目前中医治疗轻症期的方剂多以解表化湿、宣肺透热为主,以藿香正气散和连花清瘟胶囊最为典型,由表1可见5种含葛根素的中药中柴胡和葛根均归肺经,且均为辛凉解表之药。

从网络药理学分析结果可知,葛根素存在于多种中药中,作用于54个靶点。KEGG分析得出通路中小细胞肺癌通路、非小细胞肺癌通路与肺部最为相关,肾素血管紧张素通路与ACE2受体最为相关。其中肾素血管紧张素(RAS)系统既存在于循环系统中,也存在于血管壁、心脏、肺部、中枢、肾脏和肾上腺等组织内[22]。最新的研究发现[23-24]138COVID-19患者中46.4%有一或多种基础病,SARS-CoV-2下调ACE2的表达,使ACE-Ang II轴和ACE2-Ang-(1-7) 轴平衡失调,Ang II绝对或相对升高,使细胞因子(尤其促炎因子)表达升高,诱发炎症风暴,出现全身炎症反应,加重病情的发展。葛根素与ACE2SARS-CoV-23CL水解酶进行了分子对接,结果显示葛根素与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能比目前推荐使用的化学药利托那韦等的结合能更有优势,且葛根素与ACE2的结合能比达原饮中筛选得到的活性化合物(−35.56 kJ/mol)更优[25]。葛根素是否可以通过作用于ACE2受体调节多条信号通路起到治疗COVID-19的作用有待临床一线医疗工作者的验证。

目前对于COVID-19的治疗方法层出不穷,然而却没有统一的治疗金标准,可见传染性疾病发病快且治愈效果不佳。化学药由于作用靶点明确、化学结构清晰、给药剂量可控等优势,在治疗突发性以及危重性疾病中发挥着重要作用,然而却因为副作用大、耐药性等缺点带给患者很多后遗症[26]。中药由于多成分、多靶点、多环节等优势[27-28],在治疗疑难杂症以及新疾病中发挥着重要作用,然而却因为成分复杂、缺乏普适性、药效成分含量低等缺点制约着其推广和国内外认可。纵观此次治疗COVID-19的案例,中西医结合疗法是目前最为科学、高效的一种疗法,国内医疗工作者不能简单地停留在非此即彼的阶段,中西医应该取长补短,科学合理地制定出一套治疗方案才有利于疾病的治疗。笔者建议,就目前与SARS-CoV-2最为相关的受体ACE2而言,综合现阶段治愈COVID-19患者的中药处方,是否可以建立一个普适处方,再根据辨证论治优先考虑目前筛选得到的与ACE2最为相关的柴胡和葛根相加减,提高葛根素含量,再结合新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)中推荐的化学药进行综合治疗,从而达到中西医结合治疗疾病的效果。

参考文献(略) 
来  源:宗  阳,丁美林,马世堂,居文政. 以血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)为受体挖掘治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)潜在中药及单体成分 [J]. 中草药, 2020, 51: CNKI首发.
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