年龄和组织特异性的定量蛋白氧化还原图谱

哺乳动物各个器官从事的专门的生理活动会受到蛋白修饰的调节,在这些修饰中,一类很重要的就是可逆性的活性氧(ROS)对于蛋白质半胱氨酸的氧化修饰。ROS调节非常多的生物过程,而ROS失调长期以来一直被认为与年龄相关的功能障碍有联系。然而,研究者们对于ROS修饰的蛋白以及位点是什么,以及ROS修饰在各个器官中的起到什么样不同的作用却并不清楚。科学界缺乏对于ROS蛋白修饰的深入以及大规模的研究,最重要的原因就是现有的技术既有很多无法在动物组织上使用,又只能检测到很少量的半胱氨酸位点(几百到几千个位点)。除此以外,大多数技术无法检测到ROS氧化修饰的程度(% oxidation, 比如一个蛋白在细胞内有100个拷贝,其中50个在某一半胱氨酸位点被氧化修饰了,那么这个位点的氧化修饰程度,即% oxidation 就是50%)。修饰程度非常重要,因为50倍的修饰的变化可能是从0.01%的修饰程度改变到0.5%,也可能是从2%改变到100%,显然,后者会对所调控的生物过程产生比前者大及其多的影响。

2020年2月27日,哈佛医学院、Dana-Farber 癌症研究所Edward T.Chouchani团队(共同一作为Haopeng XiaoMark P. JedrychowskiCell上发表文章A Quantitative Tissue-Specific Landscape of Protein Redox Regulation during Aging开发了一种定量质谱蛋白质组学技术,能够标记并富集蛋白半胱氨酸,以及检测半胱氨酸的氧化修饰程度。

研究人员合成了一种叫CPT的化合物,用它来标记蛋白上的半胱氨酸能达到接近100%的标记效率。标记后的蛋白半胱氨酸会带有一个磷酸基团,这样的话就能够通过磷酸化蛋白质组学的方法来富集半胱氨酸,大大提高能检测到的半胱氨酸的位点的数量。在实验中,研究人员能从人类细胞中最多能观测到接近72,000个不同的带有标记的半胱氨酸肽段。这种标记方法可以和准确的定量蛋白质组学方法(比如三级质谱级别的TMT)共同使用以得到量化的检测数据。通过这种技术,研究人员对小鼠体内组织的蛋白质半胱氨酸氧化修饰进行了首次全面的定量。研究人员检测了年轻小鼠和老年小鼠的10个不同器官以及组织中的半胱氨酸的氧化程度,检测到~9,400个蛋白质上的~171,000个组织特异的半胱氨酸,对应到~34,000个不重复位点。这些位点的数量达到了前人能检测到的几十上百倍,并且绝大多数位点从来没有被检测到过。研究人员用这些数据组建了一个叫Oximouse数据库(oximouse.hms.harvard.edu),并通过对这些数据进行生物信息分析发现并总结了氧化还原信号通路在生物组织内的一些普适的以及前人没有发现的规律。
 
研究人员发现虽然不同组织中,虽然由于蛋白表达的不同检测到的半胱氨酸修饰位点数量也不同,但是这些组织中的半胱氨酸平均%oxidation都是10-20%左右。在亚细胞水平,研究人员发现半胱氨酸被氧化的程度和细胞器本身所处的氧化还原状况相关。比如线粒体由于大量的还原机制的存在和最低的氧化电势,是半胱氨酸氧化程度最低的细胞器;分泌蛋白氧化程度最高,因为细胞外没有有效的还原机制。研究人员还发现,虽然在整体水平上而言,蛋白半胱氨酸的氧化存在各个组织都共享的这些趋势,不同的组织也存在组织特异性的不同氧化位点以适应或者介导组织特异的生命活动。每个组织都有一些组织特异的位点只在特定的组织中被高度氧化。
 
接下来研究人员构建并验证了每个组织内的半胱氨酸氧化还原信号网络,并发现这些网络具有高度的组织特异性。蛋白半胱氨酸的氧化还原能够介导许多不同生命过程中的信号传递。例如通过细胞生物学以及代谢组学的方法,研究人员验证了肌肉细胞中己糖激酶上的半胱氨酸能被氧化还原调控,从而控制摄入的糖是更多地被导向糖酵解通路或者磷酸戊糖通路。当处于还原状态下,己糖激酶会控制糖更多的进入磷酸戊糖通路,而氧化会逆转这个走向。研究人员还发现氧化还原还能介导蛋白聚合物(protein complex)的聚合与解离,比如tRNA氨基酰化蛋白聚合物。
 
这些发现让作者们认识到高度氧化的半胱氨酸是少见并有组织选择性的,于是作者们便想,会不会在每个半胱氨酸所存在的蛋白局部环境中,有某些机制在控制半胱氨酸的氧化呢?于是研究人员定义氧化程度≥20%的半胱氨酸为高度氧化,其余为低度氧化,然后对这两类半胱氨酸的邻近氨基酸序列进行比较分析。研究人员发现,当半胱氨酸周围存在精氨酸时,半胱氨酸的氧化程度会更高,而存在谷氨酸和天冬氨酸时氧化程度会变低。精氨酸是碱性最高的氨基酸,而谷氨酸和天冬氨酸是酸性的。这便让作者们联想到酸碱性和半胱氨酸的被氧化能力的关系-当半胱氨酸上的巯基(-SH)处于(-S-)形式的时候,半胱氨酸会更容易被氧化,因为半胱氨酸的氧化本质上是一种亲核进攻,而(-S-)的亲核能力比(-SH)高非常多。因此,研究人员认为当半胱氨酸周围有碱性氨基酸的时候,(-SH)更容易脱氢使得(-S-)会更加容易存在并提高该半胱氨酸被氧化的可能性;而附近有酸性氨基酸的时候就会截然相反。这一规律在2D与3D的蛋白空间中都成立。下一步研究人员便想,如果半胱氨酸附近的氨基酸上有其他的修饰呢?比如附近磷酸化的存在是否也会导致酸度增加降低半胱氨酸被氧化的可能性?通过分析研究人员发现确实在大部分组织中,如果半胱氨酸周围存在磷酸修饰的氨基酸的话,其被氧化的程度会有所降低。
 
研究人员接下来对比研究了年老的和年轻的小鼠组织中蛋白半胱氨酸被氧化的情况。虽然半个世纪以来,许多研究把衰老和氧化关联起来并认为生物大分子的被氧化是衰老的主要原因,各个实验室得到的实验证据却并不充分,有时还相互矛盾。研究人员发现,在年老的小鼠体内,蛋白半胱氨酸的氧化程度并没有显著提高。令人意外的是,分泌蛋白的氧化程度在年老的小鼠体内还降低了。这可能是由于年老的小鼠代谢速率变低导致ROS的产生变少以及蛋白的分泌变少导致的。为了验证实验发现,研究人员同时还检验了不可逆的半胱氨酸氧化,也没有发现氧化程度在年老的老鼠体内会变高。研究人员还通过代谢组学检验了导致生物大分子氧化的一些小分子中间产物,还是没有发现年龄导致的差异。再者,研究人员检测了控制ROS代谢的蛋白的表达程度以及负责还原蛋白的代谢物的量,依然没有发现在年轻和年老的小鼠体内有显著差异。综上所述,Oximouse提供了强力的反对衰老是由无差别的生物大分子氧化引起的证据。反之,随着年龄变化,被氧化的位点以及被影响的生物信号网络的变化,并且这些变化不是由蛋白的表达变化引起的。研究人员发现的是ROS信号传递网络在生物衰老过程中被重塑。在研究蛋白半胱氨酸的氧化与疾病的关系中,发现在有的组织或器官中,对于衰老,ROS信号会对其进行适应甚至不良适应。比如,在棕色脂肪组织中,蛋白的氧化修饰会加速产热以及脂肪燃烧,但是在棕色脂肪组织的“体重增加”这一疾病网络里,氧化却随着年龄增长降低了,这便意味着年老个体可能会更容易受到体重增加的影响。
 
综上所述,研究人员开发了一种新技术,从而能大规模地精确定量检测蛋白的氧化情况;研究人员发现并验证蛋白的氧化是组织特异以及年龄特异的,并能控制各种各样的生命活动信息网络以及疾病网络;作者们提出并总结蛋白半胱氨酸的氧化会极大受到周围氨基酸酸碱性以及蛋白修饰的影响这一规律。总之,这项工作建立了一个研究ROS对生物体内蛋白修饰位点以及机制的基础,让研究者们能站在一个更高的平台上进一步研究氧化还原调节是如何控制各种生理现象以及疾病的。
 
 
原文链接:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.012
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