器官选择性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑

近年来,mRNA依赖的蛋白质替换和CRISPR/Cas介导的基因编辑/修复在多种疾病治疗方面有着极大的应用价值,但是体内安全、高效的递送是制约其应用的最大障碍【1-4】。由于制备过程简易和可以重复给药的特点,非病毒纳米颗粒展现出了非常好的应用前景【1】,其中脂质纳米粒(Lipid Nanoparticles,LNPs在RNA治疗中成绩最为突出,2018年8月,FDA批准的第一款siRNA药物(Onpattro)正是基于MC3 LNPs的递送技术【5】。与siRNA药物相似,当前mRNA和CRISPR/Cas的递送LNPs大多数是肝脏靶向的,肝脏以外的有效递送问题亟待解决。高通量化学合成和筛选的方法可以得到靶向肝脏以外的LNPs,如肺和脾【6-8】,但此方法工作量大、耗时长、并且具有一定的盲目性,而且很难真正给出具有普适性的LNPs设计原则。
 
2020年4月6日,来自德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授团队(共同一作为程强魏妥博士)Nature Nanotechnology上在线发表了题目为“Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing”的研究成果,报道了器官选择性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的研究成果,提出了对靶向递送LNPs的普适性设计原则SORTSORT可以对LNPs进行精准地、可预测地优化,使其快速实现肝、肺和脾的mRNA靶向递送和CRISPR/Cas9介导的基因编辑(图1),预计该结果将会极大程度地推动mRNA治疗和基因编辑领域的发展,尤其是肝脏以外的靶向治疗。
 
 图1. SORT技术实现了mRNA的器官选择性递送。
该实验室的前期研究结果表明,两性(同时带有正、负电荷)脂质组成的LNPs会非特异递送mRNA到达多种器官中(肝、肺)【6】;另一研究结果显示通过调整脂质体的表面电荷可以递送mRNA到免疫细胞中(肺、脾)从而介导肿瘤的免疫治疗【9】。基于此,作者猜想LNPs内部的电荷平衡可能是调控器官选择性递送的关键,为了验证该想法,作者选择了该实验室已优化的肝靶向递送LNPs(名为mDLNP)【10】为研究对象,在原有的4组分中引入带有电荷的第5种脂质(SORT脂质)以便调节LNPs内部的电荷。首先选择了最为常用的阳离子DOTAP脂质分子,随后构建了一系列不同组成比例的DOTAP mDLNP,通用公式为5A2-SC8/DOPE/Chol/PEG/DOTAP=15/15/30/3/X,这里X的变化使得DOTAP含量可以从0%到100%。接着,作者通过静脉给药在小鼠内体进行了mRNA的递送研究。
 
图2. DOTAP在mDLNP中占的比例决定了mRNA的器官选择性递送。
 
通过静脉注射低剂量(0.1mg/kg)荧光素酶mRNA(Luc mRNA)的纳米颗粒后,DOTAP mDLNP成功转染了小鼠体内的脏器。令人惊讶的是,随着DOTAP的比例不同,表现出了器官选择性mRNA的递送效果(图2)。0%为肝脏特异性转染、10%-15%为脾脏转染最高、之后随着DOTAP比例越高,肺部靶向性越好,且50% DOTAP呈现出最好的肺部转染效果。鉴于此结果,作者随后用相同的策略研究了阴离子SORT脂质(18PA)对mRNA的影响,结果显示引入5%到40%的18PA mDLNP特异性递送mRNA到了脾脏(图3),而在肝和肺没有检测到任何荧光素酶的表达。这些结果表明,LNPs的内部电荷的确在器官选择性递送中扮演了重要的角色。作者将这种快速筛选器官选择性LNPs的方法命名为SORT
 图3. 阴离子18PA脂质改造后的mDLNP实现了脾脏的特异性mRNA递送。
为了验证SORT的普适性,首先,利用相同的策略研究了其他类型的LNPs,作者选择了MC3 LNPs【11】和C12-200 LNPs【12】,二者均为肝靶向mRNA递送载体的金标准。分别引入DOTAP和18PA脂质以后,均得到了与mDLNP中完全一致的结果,即控制DOTAP的比例使mRNA递送到脾和肺,而18PA的加入成功实现了脾脏的特异性mRNA递送(图4),这些结果说明SORT适用于任何类型的LNPs。值得一提的是,MC3 LNPs已经是FDA批准的siRNA递送载体,通过SORT优化技术,有可能对MC3 LNPs进行快速、高效的改造,从而加速siRNA或者mRNA在肺和脾中的治疗应用;接着,作者尝试了多种不同结构但电荷相同的SORT脂质分子以证明其普适性,阳离子脂质分别使用了DOTAP、DDAB和EPC,阴离子脂质使用了18PA、14PA和18BMP,最终得到了一致的结论。说明,SORT技术不依赖脂质分子的化学结构,而是LNPs内部电荷的平衡;最后,作者尝试把SORT脂质替换为可离子化的阳离子脂质,如,DODAP,C12-200和5A2-SC8分子,这些分子在中性环境中不带有任何电荷,而在酸性条件下可带正电荷。研究结果表明,可离子化的阳离子脂质不会改变器官的选择性递送,依然具有肝脏特异性,但是通过引入20%的SORT脂质显著提高了肝脏的转染效率。至此,作者证明了SORT技术在LNPs优化中的普适性规律,简言之,阳离子SORT脂质可以控制mRNA的脾和肺靶向递送;阴离子SORT脂质可实现mRNA的脾脏特异性递送;而可离子化的SORT脂质可用于增强肝脏mRNA的转染效率。SORT技术的普适性不仅在于SORT脂质的选择上,而且适用于不同类型的LNPs中,更重要的是SORT技术对器官选择性mRNA的递送具有可预测性,无需进行大规模体内外实验筛选,这无疑会加快mRNA在今后治疗中的应用。

 图4. SORT技术具有普适性,可以被应用到其他类型的脂质纳米颗粒中,这里选择了MC3 LNPs和C12-200 LNPs为研究对象。

随后,作者分别使用了肝、肺和脾靶向SORT LNPs进行了mRNA递送和基因编辑的应用研究。首先是mRNA介导的器官选择性基因编辑,作者选用了Td-Tomato(tdTom)转基因小鼠,正常状态下,tdTom小鼠只表达本底水平的荧光,当tdtom基因前的终止信号被Cre酶或者CRISPR/Cas9切除后会激活红色荧光的表达,从而方便研究者进行检测。作者分别用肝(20% DODAP SORT)、肺(50% DOTAP SORT)和脾(30% 18PA SORT)靶向LNPs通过单次静脉递送Cre mRNA进行了器官特异性基因编辑,并且通过流式细胞仪技术鉴定了不同细胞类型的编辑效率(图5)。肝实质细胞的编辑效率接近100%,肺部的内皮细胞和上皮细胞的编辑效率分别达到39%和66%,而脾脏的B、T淋巴细胞和巨噬细胞的编辑效率分别为12%、10%和20%。这些研究结果为mRNA介导的器官特异性治疗提供了直接的证据。

图5. 器官特异性SORT LNPs通过递送Cre mRNA在tdTom转基因小鼠成功实现了肝、肺和脾的基因编辑,激活了tdTom的表达。

接着,作者从mRNA移步到了CRISPR/Cas9介导的基因编辑。SORT LNPs包裹Cas9 mRNA和sgRNA复合物,在tdTom小鼠中单次静脉给药后,分别在肝和肺脏观察到了明显的红色荧光信号(图6),虽然脾脏的编辑效率不高,但依旧可以观察到明显增加的红色荧光。随后,作者用相同的策略对内源性基因(PTEN)进行了器官特异性的基因编辑,单次给药后在肝和肺部的基因效率可以分别高达14%和15%!为了进一步研究CRISPR/Cas9基因编辑的应用前景,作者使用肝靶向SORT LNPs,采取3次给药的方法对PCSK9进行了基因编辑。基因水平的编辑效率高达60%,而血液和肝脏中PCSK9蛋白的敲除效率达到了100%!这些结果表明器官选择性SORT LNPs可以介导高水平的基因编辑效率,足以达到疾病治疗的目的。

图6. SORT LNPs通过共递送Cas9 mRNA和sgRNA在tdTom转基因小鼠和普通C57小鼠中介导了脏器特异性的基因编辑。SORT LNPs在(a,b)tdTom转基因小鼠(tdTom基因)和(c)普通C57小鼠中(PTEN基因)介导的基因编辑;(d-g)肝靶向SORT LNPs介导的肝脏PCSK9基因编辑。

总结而言,本研究创造性的提出了快速优化和筛选器官特异性LNPs的方法,命名为SORT,SORT适用于各种类型的LNPs,可作为通用的设计指导原则,且无需进行大规模体内外实验筛选。SORT LNPs显示出高效的器官特异性mRNA递送和CRISPR/Cas9基因编辑效果,预计将会极大地促进这些领域的研究。
 
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41565-020-0669-6
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