文献解读:miRNA上下游机制研究

今天小编带来的一篇文章主要研究了miRNA在胃癌中的调控分子作用,并重点阐释了与其相结合的上游及下游分子,形成一个分子轴发挥作用。虽然这篇文章只有3.8分,但适合初学者学习。不妨来看一下它miRNA上下游机制探索思路和研究方法吧。

           

1.miR-5100促进胃癌细胞凋亡并抑制自噬

首先作者发现miR-5100在胃癌组织和胃癌细胞系中均是低表。同时通过一系列的细胞实验证实:miR-5100具有促进胃癌细胞凋亡和抑制胃癌细胞自噬的作用。这些实验实验具体包括:Wb检测到在抑制了miR-5100后,细胞凋亡减少,流式也验证上述结果。同时在AGS细胞系中验证了miR-5100 Minic促进细胞凋亡。同时发现在MGC80-3细胞抑制了miR-5100后,自噬活性增强(LC3BII/I上调)且自噬小体含量增加。而在AGS细胞系中miR-5100 Minic降低自噬活性和自噬小体的数量。

           

2.CAAP1抑制胃癌细胞凋亡并促进自噬

作者发现CAAP1在MGC80-3细胞中低表达,在AGS细胞中高表达。构建CAAP1过表MGC80-3细胞。Wb和流式检测到细胞凋亡水平下降。构建CAAP1敲降AGS细胞发现凋亡水平增加。同时CAAP1促进了过表细胞中细胞的自噬。而敲降细胞中自噬小体含量减少。结论:CAAP1可抑制胃癌细胞凋亡,但促进胃癌细胞的自噬。

           

3.MIR-5100靶向结合CAAP1 3’UTR区调控其表达

作者使用TargetScanHuman数据库分析CAAP1的3’UTR序列。结果表明,3’UTR区与miR-5100之间有三个结合位点。之后利用荧光素酶报告实验验证,当增加miR-5100含量时3’UTR区荧光素酶活性被抑制。接着作者进行一些进一步验证,在此不讲了,有兴趣的小伙伴看下原文。

结果:CAAP1能直接与miR-5100结合,并受miR-5100负向调控。

           

4.MKL1抑制胃癌细胞凋亡和促进自噬并且靶向结合miR-5100

作者同时发现MKL-1在MGC803细胞中高表达,在AGS细胞中低表达。将MKL1表达质粒转染AGS细胞,发现Caspase3蛋白表达水平降低且自噬活性增加。之后在MGC80-3细胞中敲降MKL-1,结果细胞凋亡增加,自噬水平减少。

进一步对miR-5100启动子序列进行分析,发现在启动子处有MKL1的结合位点。同样使用荧光素酶报告实验表明,在miR-5100启动子中,MKL-1能促进荧光酶的活性,而miR-5100启动子突变对荧光素酶活性无影响。RT-PCR结果显示,当MKL1过表达时,miR-5100的表达量增加。然后对转染miR-5100的AGS细胞进行ChIP分析,相比于对照组,MKL1可与miR-5100启动子相结合,验证了荧光素酶结果。

结论:MKL1可以与miR-5100启动子结合促进其表达,并且MKL1能够影响胃癌细胞的凋亡和自噬。

5.MKL1靶向CAAP1启动子促进CAAP1蛋白表达

作者进一步探讨MKL1抑制胃癌细胞的分子机制,对CAAP1启动子序列进行了分析,发现同样可以结合MKL1。之后荧光素酶报告实验结果表明,MKL-1能促进CAAP1启动子荧光素酶活性。q-PCR和Wb表明,MKL1能促进CAAP1的转录和蛋白的表达。对转染MKL1的MGC80-3细胞进行了ChIP分析,MKL1能与CAAP1启动子相结合。结论:MKL1可与CAAP1启动子结合,促进CAAP1表达,抑制胃癌细胞凋亡,促进自噬。

           

6.MIR-5100对裸鼠移植瘤的抑制作用

作者构建了高表达miR-5100的AGS细胞系并注射到裸鼠体内。结果显示高表细胞的成瘤体积和重量均小于对照组。接下来,HE染色和免疫组化表明对照组肿瘤组织中CAAP1蛋白表达水平高于实验组,其中和紫杉醇联合治疗组中CAAP1蛋白表达水平最低。Wb检测表明,miR5100过表组肿瘤组织中Caspase3蛋白表达增强,而LC3B蛋白表达下调。与紫杉醇联用组裂解Caspase3蛋白表达高于对照组,LC3B蛋白表达也下调。结论:miR-5100在体内同样能促进胃癌细胞凋亡,抑制自噬。

           

7.MKL1/miR-5100/CAAP1轴调控胃癌细胞的凋亡和自噬

在这项研究中miR-5100通过抑制CAAP1的3’UTR和抑制自噬来促进胃癌细胞凋亡,而MKL1可以靶向CAAP1启动子来抑制胃癌细胞的凋亡和促进自噬。同时MKL1也可以促进miR-5100的表达。提示MKL1/miR-5100/CAAP1可能是影响胃癌细胞凋亡和自噬的反馈调节因子。作者为了验证假设,将MKL1和miR-5100抑制剂转染AGS细胞系。当MKL1和miR-5100抑制剂共转化时,Wb结果显示CAAP1蛋白的表达高于对照组,LC3BII/I蛋白比值增加,Caspase3减少,流式检测细胞凋亡水平明显降低。共聚焦显微镜下发现细胞自噬小体增加。结论:MKL1/miR-5100/CAAP1轴确实存在于胃癌细胞中,并调控胃癌细胞的凋亡和自噬。

           

研究思路

华丽丽的分割线

文章中出现的TargetScanHuman数据库也操作简便,这个网站非常实用,接下来小编就带大家还原文章中的结果。首先打开官网http://www.targetscan.org/vert_72/,输入文章中的mi-RNA,miR-5100,之后点击Submit。

           

可以看到文章中的CAAP1的Total Context++score是最低的,Total Context++score是预测靶点的综合得分,分数越低靶点的概率越大。从结果上来看CAAP1在miR-5100中有3个结合位点,与文章相符。点击Download table下载数据。

           

点击Sites in UTR后可以看到详细信息(以下展示部分)

           

好了,今天就分享到这里,希望对大家有帮助。

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