文献解读:自噬研究思路

2020年6月7日,来自美国南卡罗莱纳大学医学院的崔泰兴团队在Journal of Molecular and Cellular Cardiology杂志上发表了题为CYLD exaggerates pressure overload-induced cardiomyopathy via suppressing autolysosome efflux in cardiomyocytes 的研究性论文[1],揭示了CYLD通过抑制心肌细胞自噬溶酶体的外排,加重压力超载诱导的心肌病。

1. 引言

泛素蛋白酶体系统由泛素激活酶(E1)、泛素偶联酶(E2)、泛素连接酶(E3)、蛋白酶体和去泛素化酶(DUBs)组成,几乎涉及到细胞生物学的各个方面。cylindromatosis (CYLD)是一个去泛素化酶,它介导的心脏信号传导尚未不清楚。
自噬是细胞一种进化保守的分解代谢过程,可以靶向细胞质成分,如细胞器、蛋白质聚集物或单个蛋白质到溶酶体中降解。过程包括自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,导致自噬溶酶体降解(自噬溶酶体外排)。自噬过程十分复杂,涉及多种过程、通路及分子,不过我们看下面的图就可以大概了解了。

自噬过程(来源文献[2])
2. 研究方法
  • 各种工具鼠:野生型小鼠(Non),心脏特异性 Cyld转基因小鼠(TG), 心脏特异性Atg7转基因小鼠(Atg7),心脏特异性 Cyld,Atg7双转基因小鼠(Duo), Cyld全身敲除小鼠(Cyld KO)
  • 心肌肥厚模型构建:主动脉缩窄术(TAC)
  • 自噬流检测的方法:
    (1)  使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化:目前为止,通过伴随使用自噬晚期抑制剂,检测LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标。当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (bafilomycinA1, Baf A1) 刺激细胞时, 细胞内自噬溶酶体降解被抑制, 此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。当细胞自噬流活化后, LC3B-II的含量会在使用Baf A1的基础上进一步增加, 而当细胞自噬流阻断后, LC3B-II的含量则不会在使用Baf A1的基础上发生改变。
    (2)  串联荧光标签检测细胞内自噬流:mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧光蛋白是专门用于检测自噬流水平的融合蛋白, 自噬活化时GFP荧光信号在进入溶酶体后,由于pH值的下降会出现淬灭, 但是mRFP或mCherry荧光基团的pH值稳定性比GFP高, 在进入自噬溶酶体后仍能发出荧光。因此使用mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白时, 同时观察红色荧光和绿色荧光的强度变化可以准确判断细胞自噬活性。
    若细胞内出现绿色荧光和红色荧光共定位, 即出现黄色荧光时表明mRFP/ mCherry-GFP-LC3B融合蛋白并未与溶酶体发生融合或自噬溶酶体中的pH值较高, 进而代表了自噬流的阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时, 代表mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内, 即自噬流活化。
  • 研究自噬常用药物:
    (1)  巴弗洛霉素A1 (bafilomycinA1, Baf A1):是囊泡型-ATP 酶(V-ATPase)的抑制剂, 能干扰自噬泡与溶酶体的融合, 抑制自噬性降解。
    (2)  氯喹(chloroquine, CQ):是溶酶体抑制剂, 可通过抑制溶酶体酸化来抑制自噬性降解。
    (3)  雷帕霉素(rapamycin):是 mTOR 抑制剂,可诱导自噬。
3. 研究结果
(1)  表型发现:心脏特异性CYLD过表达加重心功能障碍,含内容物的自噬空泡增加
首先,研究者在小鼠上进行主动脉缩窄手术构建心肌肥厚模型,监测术后8周的心功能, TG小鼠的心功能障碍较野生型小鼠显著加重。

进一步,研究者在压力超载的TG小鼠中发现,心肌多聚泛素化蛋白积累增加,心脏自噬体标记物LC3-II蛋白表达水平,自噬受体蛋白p62累积增加,同时显著抑制了自噬流,且携带未降解内容物的自噬空泡增加,但不影响自噬空泡总数。这些结果提示CYLD可以抑制自噬降解,而不影响自噬体或自噬溶酶体的形成。提示CYLD可能是通过抑制心脏自噬来影响心功能的。

(2)  再次确定自噬的作用:过表达ATG7诱导心脏保护性自噬
为了明确自噬对压力超载诱导的心脏病的作用,研究者发现Atg7小鼠抑制了压力超载诱导的心肌细胞肥大、心肌纤维化和凋亡。结果表明心脏特异性过表达ATG7显著改善了压力超载诱导的心肌肥厚和心功能障碍。

(3)  体内机制研究:CYLD抑制自噬溶酶体外排
ATG7在自噬体生物合成中起关键作用,但在自噬体与溶酶体融合中不起作用,那么过表达ATG7诱导的心脏保护性自噬,是否可以逆转CYLD介导的心脏自噬抑制和功能障碍呢?研究者使用了同窝出生的Non,Cyld,Atg7,Duo四种小鼠进行主动脉缩窄构建心肌肥厚模型。Atg7小鼠增强自噬体形成,与溶酶体融合,和自噬溶酶体外排,而Duo小鼠的不良心肌肥厚和功能障碍显著加重,透射电镜显示Duo小鼠心脏含有未降解内容物的自噬空泡数量明显增加。这些结果表明,在压力超载心脏中,CYLD过表达并不影响自噬体的形成和与溶酶体的融合,而是抑制自噬溶酶体的外排。

(4)  体外进一步验证机制, CYLD抑制自噬溶酶体外排阶段
为了进一步验证CYLD在体外调节自噬通量和自噬溶酶体外排中的作用,研究者使用了两个经典的自噬流的检测方法,一是在小鼠胚胎成纤维细胞,使用巴弗洛霉素A1或氯喹抑制自噬检测LC3B-I/II转化。Cyld shRNAs的稳定过表达不影响短期(4小时)BafA1或CQ诱导的LC3-II积累,但长期(24小时)BafA1或CQ诱导的LC3-II积累增强。这表明CYLD不影响自噬体的形成,也不影响自噬体与溶酶体融合,但可能抑制融合后自噬体的清除。二是在H9C2细胞中,使用mCherry-GFP-LC3 B串联荧光蛋白检测细胞内自噬流,CYLD过表达并不影响基础自噬,而是选择性地抑制雷帕霉素诱导的自噬溶酶体外排,而不抑制雷帕霉素诱导的自噬体与溶酶体融合。

(5) 分子机制:CYLD失活mTORC1,上调Rab7,促进心肌细胞死亡
在分子水平上, mTORC1的再激活和自噬溶酶体膜上Rab7的释放很可能是自噬溶酶体外排的关键。那么mTORC1和Rab7是否也参与了CYLD抑制自噬溶酶体外排过程,从而加重了压力超载诱导的心肌病呢?研究者发现压力超载诱导的mTOR信号通路下游的p70S6K磷酸化被CYLD过表达阻断,同时溶酶体相关膜蛋白Lamp1、Lamp2和Rab7蛋白水平上调,增加了压力超载心脏的心肌细胞死亡。此外,过表达CYLD不影响压力超载诱导的真核翻译起始因子4EBP1的磷酸化(mTORC1的另一个典型底物)。另一方面,Cyld KO小鼠可显著抑制压力超载导致的心肌细胞死亡。综上,这些结果表明上调CYLD抑制mTORC1的再激活和自噬溶酶体的清除,从而加重压力超载导致的心肌细胞死亡。

4. 研究结论和意义
本研究证明CYLD是压力超载诱导的心肌病的中介子。机制上,CYLD通过选择性地中断心肌细胞自噬溶酶体外排来抑制自噬,从而将心肌自噬保护转变为自噬损伤。在分子水平上,CYLD抑制mTORC1的再激活,并阻止自噬溶酶体释放Rab7,这两者都是心肌细胞自噬溶酶体外排所必需的。此发现为自噬介导的心脏病理重构和功能障碍的调节提供了新的见解。

5. 研究思路

6. 收尾
2016年度诺贝尔生理学与医学奖授予了日本科学家大隅良典(Yoshinori Ohsumi),以奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”,自此揭开了自噬研究的热潮。细胞自噬是细胞内重要的物质分解代谢过程,当然研究起来也不是很容易,希望你能从中有所收获,我们下次文章解析再见吧!
参考文献:
[1]   Qi, Lei, et al. “CYLD exaggerates pressure overload-induced cardiomyopathy via suppressing autolysosome efflux in cardiomyocytes.” Journal of Molecular and Cellular Cardiology (2020).
[2]   Hansen, Malene, David C. Rubinsztein, and DavidW. Walker. “Autophagy as a promoter of longevity: insights from model organisms.” Nature reviews Molecular cell biology 19.9 (2018): 579-593.
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