ELISA技术:从技术细节到数据分析演示

ELISA:全称叫酶联免疫吸附试验,其原理就是:测定时,受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与溶液中的其他物质分开,再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应结合在固相载体上,加入酶反应的底物后,底物被酶催化成有色产物,产物的量与标本中要检测的目标物质的量直接相关,故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。

                  

 

试剂、仪器:包括3个必要试剂和其他的试剂、仪器

3个必要试剂:

(1)固相的抗原或抗体

常用的固相载体是聚苯乙烯,具有较强的吸附蛋白质的性能,并且抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。将抗原或抗体固定在聚苯乙烯的过程即‘包被’,2者通过物理吸附相结合。

(2)酶标记的抗原或抗体

制备结合物时所用纯度较高的lgG,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。

(3)酶反应的底物

 

其他的试剂、仪器:

操作步骤:用于检测未知抗原的双抗体夹心法(eg:ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN-γ水平)

1)包被:取空白 96 孔板,按 COA 用 PBS 稀释捕获抗体,每孔 100μl捕获抗体工作液,室温过夜;

2)洗板:每孔 350μl洗液,洗板 3 次;

3)封闭:加入封闭液 200 μL/孔封闭 ELISA 板,室温孵育 1h;

4)洗板:甩去板中的封闭液体,加入洗液 350μL/孔,洗板 3 次;

6)加样:取出包被封闭好的 96 孔板,分别加入 100μl标准品或稀释好的样品,标准品做复孔,室温孵育 2h;

7)洗板:每孔 350μl洗液,洗板 3 次;

8)加酶标抗体:按 COA 用稀释液稀释检测抗体,每孔 100μl检测抗体工作液,室温孵育 2h;

9)洗板:每孔 350μl洗液,洗板 3 次;

10)加入底物:每孔 100μl显色液,室温避光孵育 20min,连续观察颜色变化;

11)加终止液:每孔 50μl终止液,轻柔混匀;

12)读板:检测根据酶标仪器操作方法,上机检测 OD值,通过计算获得所测物质的浓度。

 

注意事项:

1、  样本采集和保存:应避免溶血、脂血标本,容易产生非特异性显色干扰;

2、  ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的;

3、  加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免在孔壁上部,并注意不要溅出及产生气泡;

4、  最好用微孔板振荡器进行洗涤。

 

数据处理:

 

1、在EXCEL表格中整理ELISA前期数据:标准值用来求标准曲线,根据标准曲线求样本值的浓度:

 

 

2、打开软件,ELISACalc,界面如下:

3、选择回归/拟合模型,根据购买的试剂盒决定,这里以四参数为例

 

4、扣除本底,也就是blank的值,并且对X、Y轴命名

 

5、点击“复制”按钮,将EXCEL表格中的数值进行复制,并点“粘贴”按钮,粘贴在ELISA Calc表格中

 

6、点击“回归/拟合”,出现曲线,并可根据r2大小判断曲线的拟合程度,越接近1,拟合程度越好。

 

7.标准曲线已知,并且Y轴是吸光值,X轴是浓度,样本值的吸光值是已知的,要根据标准曲线求浓度,也就是“由Y计算X”

 

8、复制、粘贴样本的OD值,软件直接自动计算出对应的浓度值,点击“复制”,可将计算出的数据粘贴到EXCEL表格中,进行后续作图分析。

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