细菌转化:电穿孔法

上期i实验,小编为大家介绍了实验室常用的转化(transformation)方法:热激法(heat shock)。本期的i实验』小编将继续向大家介绍另一种高效的转化方法——电穿孔法(electroporation)的原理和实验操作流程。

电穿孔最初用于将DNA引入真核细胞,后来被广泛用于细菌转化。电穿孔法是将DNA转移到多种革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中的有效方法,有报道表明利用该种方法每μg DNA可实现109个电转化体。

电穿孔是一种物理转化方法,它使用电脉冲在细胞膜上形成临时孔,核酸等物质可以通过这些孔进入细胞。 这是一种将外源核酸引入许多细胞类型(包括细菌和哺乳动物细胞)的高效方法。

在宿主细胞和待转入的分子悬浮在导电溶液中,溶液中围绕混合物形成闭合电路。 此时,向溶液中释放仅持续几微秒至毫秒的电脉冲,这些脉冲会扰乱膜的磷脂双层结构并导致其形成临时的孔,同时,穿过细胞膜的电势升高,从而使带电分子(如DNA)以类似于电泳的方式穿过孔,进入细胞内部。

 

制备电穿孔细菌比制备使用热激法时所用的感受态细胞要简单,效率也高于热激法。大致的流程是将生长至对数中期的细胞用冰冷的灭菌去离子水(也有实验方案用甘油)清洗,降低溶液的离子强度后(为了防止电弧放电),加入10%甘油,-70℃冻存即可。

▼ 制备电穿孔细胞

挑取单克隆培养过夜

次日,将培养液接种后,振荡摇菌至OD600为0.4左右

将摇好的菌置于冰上孵育(15min-20min)

用灭菌水反复洗涤细胞后,离心,弃去上清后,用10%的预冷甘油重悬细胞,分装后置于-80℃保存。

▼电转

在冰上复苏感受态细胞

添加待转入的DNA后,继续再冰上孵育

将混合物加入电击杯中,注意这个过程不要出现气泡

设置好电压等参数,进行脉冲。听到指示音(蜂鸣声)后,向电击杯中加入LB培养基

将电转后的菌液培养40min(复原)

涂抗性平板,进行筛选,菌落计数计算转化效率(转化体数量/μg DNA

多种因素会影响电转的效率:大肠杆菌的基因型、细菌的生长状态、制备温度,以及电脉冲的时间和强度等。

▼试剂与实验材料

由于电转会杀死部分细胞,所以一般需要的细菌量要高于热激法,相应的DNA浓度一般为1-10μg/mL

实验室一般会使用一次性的电击杯,使用之前可置于-20℃冰箱中预冷。

▼实验操作

电转前用双蒸水、75%乙醇清洗电转杯,再用无水乙醇冲洗并挥干,在冰上预冷

待转化的质粒等需要在转化前除盐纯化

电转前的实验操作应在冰上进行

电压设置对于转化效率至关重要,电压过低会降低转化效率,过高的电压会击穿细胞,造成细胞死亡。不同厂家的电穿孔仪的电转条件会有所差别,实验前要仔细阅读使用说明。

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