PCR专题(1): 带你认识基础PCR实验

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的技术,PCR技术能够实现短时间内微量DNA分子的大量扩增。PCR技术是现代分子克隆技术的基石,更是一种必不可少的技术。i实验』将于近期推出PCR技术专题,带领小伙伴们更加深入的了解PCR技术。

 

 

PCR技术由美国Cetus公司的科学家Mullis发明,Mullis也因该项成就获得了1993年的诺贝尔化学奖。1989年,Science将PCR技术评为当年的十大科学发明之首,并将热稳定的DNA聚合酶评为“年度分子”。

随着DNA分子结构的发现,60年代末期,科学家们开始研究基因的体外分离技术。早在1971年,科学家Korana就曾提出核酸体外扩增的设想。美籍印裔科学家哈尔·葛宾·科拉纳 (Har Gobind Khorana)破译遗传密码,首次完成丙氨酸tRNA编码基因的完成。体外扩增DNA的需求变得越来越大。

Mullis最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段Klenow片段不耐高温,这就导致PCR每次循环都要重新加。另外,引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,这就导致了合成的DNA片段不均一。幸运的是,1986年, Cetus公司在原有基础上优化了PCR的条件,在Mullis的建议下使用了由Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶1987年,PerkinElmer推出了热循环仪,该仪器可调节反应温度,并根据需要加热或冷却样品。这些优化极大提高了扩增片段特异性和扩增效率,也促进了PCR技术的的广泛推广。

总的来说,复制过程分为3个阶段,即复制的起始复制的延伸复制的终止。复制的过程以半保留、半不连续的方式进行。

  • DNA复制时,总是从某一特定区域开始,这个区域成为复制起点(ori),通常来说,原核生物DNA上的起始位点较少,而真核生物DNA上具有多个起始位点(人体细胞内DNA含有10万个复制起点)。DNA复制时,只有局部区域的双链会打开,形成复制单位,即复制子(replicon)。
  • 由于DNA聚合酶只能催化从5’ → 3’的反应,因此,只有一条DNA链可以连续合成子代DNA,该条DNA称为先导链。合成先导链时,首先由引物酶在模板链的3’端合成一段RNA引物,再由DNA聚合酶在其3’端加上dNTP。另一条以不连续的方式进行合成的DNA成为后随链,后随链上会形成多个引物,每个引物后会形成几百个脱氧核糖核苷酸的DNA片段,也称为冈崎片段。
  • 当复制叉移动到复制终点时,复制停止。

 

  • PCR模仿了DNA在生物体内的复制过程,以温度循环的方式启动及终止DNA的合成反应。

  • PCR也分为三个阶段:高温变性、退火和延伸

  • 在高温条件下(94℃-98℃),DNA的双链变性(denaturation)会解离成单链;适当地降低反应体系的温度(50℃-60℃)后,反应体系中的引物便可与游离的单链模板相结合,这个过程称为退火(annealing),也称为复性。在72℃左右的条件下,由热稳定的DNA聚合酶催化延伸(elongation)过程,即在3’-羟基末端加入dNTP。

  • 循环以上过程可使DNA的扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y即为DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。

  • 反应初期,靶序列DNA片段呈指数增长,随着反应的进行,被扩增的DNA片段逐渐进入线性增长期或静止期,即出现平台效应。

体内DNA复制过程与PCR的区别

目前,PCR技术已经广泛应用在基因克隆/探针制备(原位杂交)、基因表达水平、基因突变的检测(检测插入、缺失等信息)、基因定位(分子标记)等实验中,广泛应用于法医检测、诊断试剂开发等领域。

目前,PCR技术以衍生出多种变体,常见的PCR类型包括反向PCR、不对称PCR、荧光定量PCR、逆转录PCR、RACE-PCR、巢氏PCR、降落PCR等。i实验』也将于近期推出这些技术的讲解推送,敬请小伙伴们关注。

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