研究蛋白质与DNA相互作用的利器:染色质免疫共沉淀(ChIP)

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,简称为ChIP)也称结合位点分析法,是基于体内分析发展而来的方法,它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定基因组区域结合蛋白质或确定与特定蛋白结合的基因组区域的好方法。ChIP被用来研究细胞内蛋白质与DNA相互作用,例如,确定特定蛋白(如转录因子)是否结合特定基因组区域,如启动子或其它DNA结合位点;在很多研究中,这项技术还可帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。

CHIP实验的基本原理和主要应用

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在,研究DNA与蛋白质在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的主要途径。ChIP是目前唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

ChIP与其它方法的结合,扩大了其应用范围:

基因芯片与ChIP相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;

第二代测序技术与ChIP相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA序列;

c  RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。ChIP技术主要应用于:1)组蛋白修饰研究,2)转录调控分析, 3)药物开发研究;

有丝分裂研究;

e DNA损失与凋亡分析。

随着ChIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥出越来越重要的作用。 

CHIP实验种类的介绍

通常使用的ChIP染色质免疫沉淀法可根据第一步中对染色质处理方式的不同,分为交联染色质免疫沉淀 (XChIP) 与自然染色质免疫沉淀 (NChIP) 两种。 XChIP 使用化学物质交联染色质后再使用超声波破碎,而 NChIP 使用micrococcal核酸酶进行剪切。

交联染色质免疫沉淀 (XChIP)

交联染色质免疫沉淀,主要用于定位染色质上面附着的转录因子等蛋白,该方法的原料是可逆交联处理后的染色质。可逆交联处理这一步,通常使用的是紫外光照射或甲醛;相对应的,后续步骤中需解除交联。交联法通常直接使用超声波破碎,获得约 300-1000 bp DNA 片段。

自然染色质免疫沉淀 (NChIP)

自然法主要应用于定位组蛋白修饰所影响的 DNA 序列。与交联法不同,自然法的原料是未经处理的染色质。为了将染色质分离,需要使用 micrococcal 核酸酶用于分离、消化染色质以获得单个核小体。此方法可以完全分解核小体间的连接 DNA 并产生长度为 1-5 个不等的核小体片段。

CHIP实验的关键步骤和需要注意的细节

ChIP 一般流程(以交联染色质免疫沉淀为例):甲醛处理细胞、收集细胞,超声破碎,加入目的蛋白的抗体、与靶蛋白-DNA复合物相互结合,加入ProteinA/G结合抗体靶蛋白-DNA复合物,沉淀对沉淀下来的复合物进行清洗,除去非特异性结合洗脱,解交联得到富集的靶蛋白-DNA复合物,纯化富集的DNA-片断进行PCR分析或基因测序等。以动物细胞为例,如下为 ChIP 实验关键步骤和需要注意的细节:

细胞培养及固定

操作1ChIP实验所需的最低细胞数为 105左右,一般会选择10 cm直径的培养皿进行细胞培养(达到8090% 细胞汇合率)。为了便于细胞计数,可以培养两皿细胞,对每一皿细胞数目进行估测,选择最佳浓度。甲醛是常用的细胞固定剂,可造成DNA与蛋白质之间的共价交联,这种交联是可逆的。务必使用在有效期内、避光保存的分子生物学级别或分析级的甲醛(Formaldehyde,甲醛饱和水溶液,浓度37%),用培养基稀释到1%(即稀释37倍)。在室温固定1015分钟,时间不宜过长,避免过度固定。甲醛的交联反应结束后,通过加入甘氨酸溶液终止反应。

细胞核提取和染色质DNA 切割

1. 首先,细胞核提取和染色质破碎所用的缓冲液均需要补加蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor CocktailPIC),现配现加、新鲜使用。另外,细胞核提取缓冲液中还需要加入DTT,以保证后续染色质酶切的效率。整个细胞核和染色质的提取过程需要在冰上操作。

2. 获得合适的染色质片段,是ChIP实验成功的第一步。目前大多数方法中推荐使用超声破碎仪进行染色质片段化处理,它可以产生随机片段,免去使用酶切反应片段化过程中可能产生某些染色质片段富集引入偏差。

随着ChIP 技术的不断优化,在对甲醛固定的染色质复合物中DNA进行切割时,传统超声随机打断DNA的方法逐渐被酶解法所替代。利用微球菌核酸酶的切割特性(在染色质核小体之间的DNA更易被切开),可以快速温和地将染色质DNA切断,且最大限度地保持了细胞原有染色质结构以及目的蛋白与DNA的结合状态,使ChIP的结果可信度和准确性大大提高。

染色质酶切后,一般需要对酶切的效率进行判断,方法如下:首先分出 50 μL的酶切后染色质,将染色质解交联,然后利用纯化柱将解交联后的DNA纯化。取 10 μL纯化后的DNA样品,用1%琼脂糖凝胶电泳测定核酸片段大小(使用100 bp DNA ladder 作为Marker),消化后的DNA的理想长度约150~900 bp1 5 个核小体 DNA 的长度),消化过度将只能得到一条带(200 bp 左右),未充分消化的染色质DNA呈弥散状,或在高分子量区域和加样孔内仍然有DNA残留。为了保证酶切的最佳效率,通常需要进行滴定法确定微球菌核酸酶与染色质量的最佳比例。

合适的染色质DNA浓度,对于后续的免疫沉淀和DNA检测是非常关键的。将酶切后的染色质DNA,取出部分经解交联和纯化后,进行DNA浓度测定。具体方法:纯化的DNA进行50倍稀释,然后测定OD260吸收值。DNA浓度=OD260吸收值×2500,理想的浓度应在 100~200 μg/ml

染色质免疫沉淀

1. 所有染色质免疫沉淀使用的缓冲液和洗涤液都需要补加蛋白酶抑制剂(PIC);所有染色质免疫沉淀步骤都必须低温(冰上或 4 ℃)操作;

2. 进行一次标准的染色质免疫沉淀,每一个实验组(例如,用同一药物处理的不同时间点的样品)需要分别设置目的蛋白管、input 样品管、阴性对照管和阳性对照管。

目的蛋白管:进行一次标准的染色质免疫沉淀,需要510 μg酶切后的交联染色质(此样品量指染色质中DNA的含量),用ChIP 缓冲液稀释后(通常稀释4倍,稀释后的ChIP 体系不得小于500ul)进行。首先,从ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管中取2%体积的染色质作为input管样本,不进行免疫沉淀反应,暂时保存在-20 ℃冰箱(等待后续其它样品免疫沉淀步骤完成后,一起进行解交联和 DNA 纯化)。然后,在剩余的目的样品管染色质中加入对应的ChIP级抗体,加入的抗体量一般在 1~5 μg,不宜加入过多的ChIP抗体,具体用量请参见产品说明书。

Input 样品管:每个实验组分出的Input 样品作为组内参照DNA,要与经过不同ChIP抗体免疫沉淀后捕获的对应 DNA 样本一起完成解交联和DNA纯化后,通过测定(如定量PCR)进行比较,计算ChIP沉淀的效率。

阴性对照管:一般可以取ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染色质作为阴性对照管样本,然后加入正常同型 IgG 抗体(例如,目的蛋白管所用的 ChIP 抗体如果为兔抗,此时就需要用正常兔 IgG,加入正常兔 IgG 抗体量与目的蛋白的 ChIP 级抗体量相同)。

阳性对照管:一般可以取 ChIP 缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染色质作为阳性对照管样本,然后加入与目的蛋白的 ChIP 抗体量相同的H3组蛋白抗体或者RNA polymerase II抗体,进行后续沉淀反应。阳性对照管选择的抗体,常常在整个染色质结合位点丰富,用于检测实验操作是否正确,对于初次进行ChIP实验的操作者推荐使用。

3. 上述各样品管加入抗体后,盖上盖子,用封口膜封紧管盖,在4 ℃的翻转摇床上,孵育4 小时以上或过夜。

注意ChIP抗体的特异性对于ChIP结果至关重要,决定了ChIP数据的质量和可信度。需谨慎选择。

4. 加入30 μLChIP级蛋白G微珠,在4 ℃的翻转摇床上孵育2小时。注意:琼脂糖微珠要选择 ChIP专用的,使用 BSA 和鲑精 DNA 进行封闭 (blocked with BSA and sonicated salmon sperm DNA)。微珠一般需保存在一定的缓冲液中,由于静置时会沉在底部,在吸取前一定要充分摇匀。微珠一般直径较小,建议使用200 μL的枪头,并将前端0.5 cm部分剪去并用酒精灯烧圆,防止在吸取时刮伤微珠表面。

漂洗沉淀后的染色质

充分漂洗对于降低非特异性吸附在微珠上的染色质非常重要,因此建议利用低盐/高盐洗涤液多次洗涤。每次洗涤后要将管内的上清液尽量吸干;如果实验使用琼脂糖微珠,由于该微珠是通过离心沉于管底,在吸取上清时要格外注意,防止吸走微珠而造成损失。

e ChIP DNA的洗脱和纯化

1. 清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100 μL 10% SDS100 μL 1 M NaHCO3800 μL ddH2O,共 1 ml 每管加入 250 μL 洗脱 buffer,室温下颠转 15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤1次。最终的洗脱液为每管 500 μL

2. 解交联:每管中加入 20 μL 5 M NaClNaCl 终浓度为 0.2 M)。混匀,65 ℃解交联过夜。在洗脱步骤完成后吸取洗脱上清时要格外注意,防止吸走微珠而造成样品污染。同时要注意每个样品管吸取等量的上清,防止造成样品间误差。

3. DNA样品的回收:解交联结束后,每管加入μL RNaseA37℃孵育1 h。每管加入10 μL 0.5 M EDTA20 μL 1 M Tris.HClPH6.5),μL 10 mg/ml 蛋白酶 K45 ℃处理 2 h。利用胶回收试剂盒,将最终的样品溶于100 μL ddH2O中。

利用定量 PCR 对各组 ChIP DNA 进行检测和富集效率分析

CHIP实验常见问题及解决方法

问题一: 非特异性抗体对照背景高;
可能原因: 1 非特异性结合 Protein A G beads2 ChIP 缓冲液污染了,有些 Protein A or G beads 产生高背景;
解决办法: 1 将标本和 beads 混合孵育1 hr后去除,然后再加入抗体进行反应(包括预纯化标本步骤),重新配制新的缓冲液,有些 Protein A/G beads 产生高背景,尽量使用在非特异性对照中背景很低的 Protein A/G beads
问题二: 背景高、电泳结果难以分辨大小;
可能原因: DNA 片段太大;
解决办法: 对不同类型的细胞,DNA片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于 1.5 kbp。如果使用酶消化染色质的话,应该可以看到单个核小体的存在 (175 bp)
问题三: 信号弱;
可能原因: 1 染色质的片段太小了,如做的是 X-ChIP,有可能是细胞被交联太久,染色质用量不足,免疫沉淀用抗体量不足,特异性的抗体结合被清除了;
解决办法: 1 染色质超声破碎的大小不能小于500 bp,太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉,如果做N-ChIP,酶切反应足够来片段化染色质了;用甲醛交联10-15分钟然后用 PBS 洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛。过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合;推荐每次实验染色质的用量是 25 μg推荐使用 3-5 μg抗体进行初次实验,如果没有信号则可以增加到 10 μg的用量;洗液中的 NaCl 浓度不能高于 500 mM,因为这个浓度过强,有可能会消除特异性的抗体结合。
问题四: PCR 扩增出现问题;
可能原因: 1 所有标本包括模板对照PCR结果信号均过高,2 标本PCR结果阴性;
解决办法: 1 Real-time PCR 溶液污染了,换用新鲜配制的新溶液重新进行 PCR使用standard/input DNA 确认引物是否正确。
基础实验

q225高级热循环设置详解

2020-8-14 23:33:42

基础实验

Western Blot内参抗体蛋白的选择原则

2020-8-14 23:35:56

0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
购物车
优惠劵
今日签到
有新私信 私信列表
搜索