划痕实验

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。免疫反应、炎症反应、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

划痕实验是最简单、经济的研究细胞迁移的体外试验方法,其原理是:当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。其一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,适合研究细胞与胞外基质(ECM)、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。

该实验一般适用于上皮,纤维样细胞系,本身有迁移能力,且较强;有极性,方便测量,观察;对无血清有较强的忍受力。

一. 实验准备(所有器材都要灭菌,紫外消毒至少30min。)

(1) 直尺和marker笔

(2) 胰酶、细胞培养基、无血清培养基

(3) 六孔板。

(4) 枪头、试剂、PBS

二.实验步骤

1.细胞分盘

将细胞种在六孔板中,孵育8-24h。细胞数量因细胞不同而不同,要求过夜能铺满。(一定要等到细胞铺满,彼此之间没有空隙,否则会影响后续数据分析。

注意:可以先用marker笔在六孔板背后,用直尺比着,均匀划一条横线,大约每隔0.5-1cm一道,可以画穿孔的直径,也可以画井字(可选步骤);手动划痕,不能保证每次划痕的一致;进行划痕时会对边缘的细胞造成机械损伤,因此可以选择使用划痕插件。

2.划线

第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直。细胞划痕最重要的是线尽量画直,且实验组和对照组细胞宽度相近,保证实验组和对照组可比性。

有条件的同学可以选择culture Insert,将细胞接种于Dish中间的Insert培养。细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500um宽度的划痕。

3.冲洗细胞

用PBS轻轻洗3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基,根据需要设加实验组、对照组。

4.培养、拍照

放入培养箱培养,按0,12,24h取样,拍照。拍照时“划痕”的方向最好在视野内为水平的或者垂直的。

 

5.图像数据分析

用ImagePro Plus进行分析, ImageJ也可。

1) 打开软件,点击file→open,选择你需要处理的图片。

2) 选择区域之前,可以先对图片处理一下,加强细胞的轮廓。点击process→filters→edge→sobel→点击apply。中间黑色的划痕区域可以用描绘工具中的魔棒工具来选择。点击irregular AOI→NEW AOI,圈选中间黑色的划痕区域。

3) 测量,除了测量面积之外,还可以测量外框长度,也就是划痕的长度,也就是图片的整体高度。点击count/size→measure→selectmeasurements→Box Height(这就是划线的长度)。

4) 点击edit→convert AOI(s) to Object(s) →view→meaurement data。

5) 划痕的平均宽度=Area/Box Height

注:一个要注意的问题,随着细胞的不断迁移,划痕会不断缩小,在计算不同时间点划痕宽度的缩小时,不要计算其相除的比例值,而是要计算想减的差值。

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