流式细胞术检测细胞周期注意事项

这篇推文来自我一个厦大的小老弟超超的经验分享。小老弟很有才,科研工作做的也很出色。

碎碎念

      化合物可以通过诱导周期阻滞,实现诱导细胞凋亡。目前笔者所在的实验室在筛选诱导肿瘤细胞周期阻滞的小分子化合物方面,主要通过蛋白印迹法和流式细胞术初筛。

     由于流式细胞术已经十分成熟,网络上可以查询到细致的操作步骤,因此这里,以经验出发,主要介绍周期检测过程中些需要注意的地方。

注意的事项

1. 选择合适的细胞系,不同的细胞系由于细胞形态、直径等不同,会对结果的美观程度有一定的影响,笔者常用HeLa细胞系,峰形较细,周期各阶段明显区别,结果美观。

2. 建议选择6孔板操作,细胞给药密度在40%左右,给药时间不一定要与蛋白印迹法给药时间一致。这是由于蛋白印迹法检测的是蛋白表达的变化,例如给药10小时,蛋白上可见明显变化趋势,但10小时收样时,孔内细胞已经明显观察到细胞漂浮凋亡,那对流式检测的结果会有很大的影响。流式细胞术收样时,尽量保证孔内细胞还未漂浮。

3. 收样时,如果孔内已经有细胞漂浮,细胞上清悬浮液也要收集。建议选用胰酶消化,消化时间必须严格控制,及时终止消化,消化时间太久,容易对细胞造成损伤和死亡。

4. 收集细胞时,离心机选用4℃,1000 rpm离心5分钟,小心吸去上清。加入0.3 mL预冷的PBS,用手指将管内的细胞弹匀,再加入0.7 mL预冷的无水乙醇,4℃固定过夜。整个收样过程中,不要用枪头吹打细胞,一是会损伤细胞,二是造成细胞损失。

5. 上机前,离心机选用4℃,1000 rpm离心5分钟,弃去上清。此时格外需要注意的是由于不同时期细胞的重量不一样,离心后细胞不是全部沉淀在管底,管壁上也会存在大量细胞,去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液,避光染色15分钟以上,上机测试前最好使用200目筛网过筛,以免细胞聚集堵塞机器管道。

结果分析

由于所用实验仪器不一样,仪器自带的软件和处理方式不一样,因此笔者主要分享自己实验室仪器分析的结果样式。

这里红色标记的是G0-G1期,绿色标记S期,蓝色标记G2-M期。

与上图是同样的一组结果,只是框选的范围更大。红色之前的紫色一般认为是已经凋亡的细胞,蓝色之后的橘黄色被认为是六倍体。我们将G0-G1期二倍体拖到直方图横坐标50的位置,那么对应的100的位置就是四倍体的位置,150就是对应六倍体。

上图是同一种化合物处理两种细胞系得到的结果。有时候结果不好看,可能是细胞的状态不好,细胞发生黏连。所以选择合适的细胞系和良好的细胞状态极为重要。

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