实验教程|石蜡切片技术

瓜瓜师姐今天给大家分享凋亡细胞的单细胞电泳检测实验技术教程,希望能够对大家有帮助~(你们的关注与转发是瓜瓜持续分享实验技术的动力)

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

01  原理与应用

  • 除水分:新鲜人体或动物组织含有水分,经石蜡处理后,石蜡替代了组织内的水分,从而可制成切片,并良好地保存组织和细胞的结构。
  • 组织学切片是观察组织结构的前提和必要条件。

02  仪器与设备

  • 仪器与材料:恒温干燥箱、石蜡切片机,展片盒、烤片机、拨针、标本瓶、标签纸、滤纸、镊子、刀片、量筒、漏斗、滴管、酒精灯、切片刀、小木块(或蜡块托)、蜡铲、载玻片、毛笔、切片盒、切片架、蜡杯、浸蜡盒、包埋盒。
  • 材料和试剂:固定液、70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、切片石蜡、蛋白甘油。

03  试剂配制

  • 固定液:多采用10%甲醛水溶液。取10ml甲醛再加入蒸馏水90ml。
  • 70%乙醇:取95%乙醇70ml再加入蒸馏水25ml。
  • 85%乙醇:取95%乙醇70ml再加入蒸馏水10ml。
  • 95%乙醇(原装)。
  • 无水乙醇(原装)。
  • 二甲苯(原装)。
  • 切片石蜡(熔点为54~62℃)。
  • 蛋白甘油:取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合,至均匀为止。加入约为1%量的麝香草酚(一小粒),借以防止微生物的侵入和腐败。置冰箱备用。

04  实验步骤

  • 取材与固定:根据不同的实验目的,选择相应的组织材料,及时投入盛有固定液体的标本瓶中,组织要求新鲜,避免挤压,挫伤和干枯。固定液的用量一般为材料的10~15倍或稍多,常规固定时间为12~48h(根据组织块大小而定)。
  • 打开恒温干燥箱调至62℃(熔蜡)

    ①放入两个盛有适当熔点石蜡的蜡盒使蜡熔化,组编为(I)号、(II)号。

    ②放入盛有适当熔点石蜡的蜡杯使蜡熔化(包埋备用蜡)。

  • 脱水与透明步骤

    ①倒出固定液。

    ②70%乙醇,1~2h(根据组织块大小而定)。如不及时使用,可放入冰箱4℃保存。如间隔时间较长,可在乙醇中加入适量甘油,再放入冰箱中保存。

    ③85%乙醇1~2h(根据组织块大小而定)。

    ④95%乙醇,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共1~2h(根据组织块大小而定)。

    ⑤100%乙醇,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共1~2h(根据组织块大小而定)。

    ⑥二甲苯,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共40min~2h(根据组织块大小而定)。

  • 浸蜡透明的组织:从二甲苯中取出,立即放入(I)号蜡盒,0.5h后放入(II)号蜡盒,一股为1~1.5h(根据组织块大小而定)。
  • 包埋:将熔化蜡倒人包埋盒,用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置,待石蜡全部凝结变硬即可取出。
  • 修切蜡块:把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形,注意勿太靠近组织,让组织四周留有少许石蜡,蜡块两边必须切成平行的直线,以免切下的蜡条弯曲。
  • 固定蜡块:取小木块,用蜡铲在酒精灯上加热,使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上,冷却后装在切片机上。
  • 载玻片:取干净的载玻片涂以甘油蛋白:以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴,轻轻滴于载玻片中央,常以洗净的手指加以涂布,涂布的面不宜太广,而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多,否则,会形成白膜,妨碍观察。
  • 切片:在开始切片前,先熟悉切片机的构造和用法,装上切片刀,注意刀的倾角不宜过大,亦不宜过小,大致,上以20~30C为宜。如倾角过大,则切片上卷,过小,则切片皱起。
  • 切片时应做到下列各点:

    a.调整刻度指针到要求的厚度,一般要求5~8μm,切片刀要拭净;

    b.用右手摇切片机转轮,左手持毛笔托住蜡带,转动切片机时不可太快,用力宜均匀,不可时快时慢,防止机器振动太厉害,以致切片厚薄不均匀;

    c.用毛笔托住蜡带,放在展片盒内(水温宜在48°C左右)展片。

  • 贴片:蜡带受热即自动展开,也可用拨针轻轻拉开。待蜡片完全展平后,用滤纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡,否则在展片时气泡会扩大,甚至致使切片破损、变形,影响组织观察。
  • 烤片:将贴片置人37~62*C恒温干燥箱干燥12h。干燥后片子常温、阴凉处保存待实验时用。

05 注意事项

  • 在85%乙醇内组织可保留较久,如果当天来不及做完,可暂保存一晚,第二日再做。
  • 组织放入二甲苯后,待组织块透明后,立即浸蜡,外曝露时间过长组织易干。
  • 浸蜡以前,先做好准备工作,恒温干燥箱中分装在(I)号、(I)号蜡盒的石蜡应已完全熔化,保持恒定。
  • 蜡片出现裂隙或碎裂可能与组织浸蜡不足,或浸蜡温度过高,或在透明剂中时间过久有关,组织易发脆。
  • 蜡片厚薄不一可能与刀或蜡块未固定牢,切片机磨损发生故障有关。
  • 蜡片卷起可能与刀口太钝或不清洁,刀的角度过大或石蜡过硬有关,试用手温或温水在蜡块,上轻涂布一下。
  • 蜡片易粘在切片刀上或蜡片皱缩可能与室温过高、刀的角度过小或石蜡太软有关,试用冰块冰一-下即可。
  • 蜡带弯曲可能与蜡块上下不平行,刀钝,蜡块不与刀刃平行有关。

06 实验结果与分析

  • 最终可通过染色后标本观察、检验从一一个方面了解石蜡切片的质量,娴熟的石蜡切片技术可为组织学、细胞生物学、分子生物学以及免疫学等科学研究提供良好的平台。
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