技术:Thermal Shift Assay (热漂移检测)

Thermal Shift Assay是一种定量测定蛋白质在不同环境下热变性温度的变化,基于这条性质,它可以有很多应用途径,如:检测小分子与目的蛋白是否结合,或用于候选药物的靶向鉴定和靶向结合等。

今天呢主要为大家介绍:利用Thermal Shift Assay检测小分子是否与目的蛋白结合的具体实验步骤!!

Figure  1. The thermal shift in the denaturation temperature of soluble proteins bound  to small-molecule ligands. (Andreotti 2015)

步骤如下

Step 1:细胞铺板

Step 2:准备重悬溶液:若目的蛋白为激酶,需准备 kinase buffer;若目的蛋白非激酶,准备PBS即可,随后在重悬溶液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂

Step 3:消化细胞(注意目的蛋白是否属于膜蛋白,若是膜蛋白消化时需特殊处理(如上图所示)),离心后PBS清洗 x 2,1 ml重悬溶液进行重悬,并转移到1.5 ml EP管中

Step 4:吹打均匀后,将EP管置于液氮凝固,5~10 sec,再放入37℃水浴锅融化,反复三次,从而达到裂解细胞的目的

Step 5:随后,离心(20000g,4℃,20 min),弃沉淀,将上清液转移到新的4 ml EP管中,随后再分装成两管

Step 6:裂解后进行实验处理:其中一管加入H20(对照组),另一管加入实验所需浓度的小分子,混合均匀后室温放置10~30 min

Step 7:设置不同的温度梯度,随后将上述处理组分别分装到八联管中,50 μl/管,分装数量与温度梯度的个数一致

Step 8:各样品在不同梯度温度下加热3 min(可利用PCR仪设置)

Step 9:室温冷却3 min后,再将上述溶液分别转移到新的1.5 ml的离心管中,离心(20000g,4℃,20 min),随后再分别取上清至200 μl EP管中

Step 10:这里不需要蛋白质定量,直接加loading buffer,Western Blot跑胶检测目的蛋白含量即可

实验做完了,那结果该怎么看呢???

一般蛋白会随着温度越高热稳定越差,也就是图中对照组会显示目的蛋白量随着温度的升高而降低;如果小分子与目的蛋白结合的话是会改变目的蛋白的热稳定性(有可能提高目的蛋白的热稳定,也有可能降低目的蛋白的热稳定性,但是总归会影响目的蛋白的热稳定性),也就是说图中实验组会显示出与对照组不一样的趋势,具有显著差异即可判断小分子与目的蛋白有结合。

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